海洋细菌的分离、筛选及活性菌株的分离

海洋细菌的分离、筛选及活性菌株的分离

1海洋微生物活性物质与陆生生物的次生代谢相比，生物多样性生活环境复杂，类别多样化，因此天然产物具有许多新的结构骨架和独特的化学结构，在生物活性方面发挥着更积极的作用。通过这项研究，许多科学家发现，海生动物中的一些活性物质来自一般水生微生物。由于海动物中活性物质含量低、生物量有限，因此海洋微生物作为活动物质的可持续资源得到了国内外研究人员的认可。微生物在海洋环境中分布广泛,或生活于海水中,或存在于沉积物和海泥中,或与海洋生物处于共生、共栖、寄生或附生的关系.特别是海洋生物附生微生物,由于在空间、营养、光线等方面的竞争关系,能产生许多具有工业和药用价值的天然产物.而且培养这类微生物的条件更接近于自然水体,相对于海洋生物内共生微生物要容易得多,从这类微生物中寻找天然产物为开发海洋活性物质开辟了新的空间.本实验从山东青岛、烟台以及浙江南麂岛潮间带水域分离海洋细菌,研究其抗菌和细胞毒活性,比较了活性细菌与来源的相关性,为今后海洋微生物活性物质的研究进行了前期工作.2材料和方法2.1采集材料及测定条件2002年6月在浙江南麂岛潮间带采集海水、海泥及海洋生物样品:链状节荚藻(Lomentariacatenata)、冈村凹顶藻(Laurenciaokamurai)、裂片石莼(Ulvafasciata)、珍珠膜海绵(Hymeniacidonperleve)、真丛柳珊瑚(Euplexauracurvata),2002年8月在山东青岛、烟台沿海潮间带采集海水、海泥、孔石莼(Ulvapertusa)、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)、叉枝藻(Gymnogongrusflabelliformis)、海带(Laminariajaponica)、海葵(未鉴定)和石鳖(未鉴定).2.2学习方法2.2.1u3000酸研磨法1)生物样品的处理:剪取0.5g样品,用无菌海水漂洗3遍,除去非附生细菌,加入10ml无菌海水25℃研磨,再用无菌海水稀释为10-1、10-2两个稀释度;2)海泥样品:称取0.5g样品加入10ml无菌海水,振荡摇匀后静置,吸取上层海水用无菌海水稀释为10-1、10-2两个稀释度;3)海水样品:用无菌海水稀释为10-1、10-2两个稀释度.2.2.2培养基的制备细菌分离培养基采用1/10Zobell2216E固体培养基.样品涂布后25℃培养20d,挑取不同形态、不同色素的单菌落转入斜面培养,经2次纯化后8℃保存.2.2.3活性物质的提取纯化菌株活化2d后接种于装有300mlZobell2216E液体培养基的三角瓶中,25℃培养7d.培养液离心(5000g×30min)除去菌体,用乙酸乙酯(100ml×3)提取上清液,乙酸乙酯相37℃蒸干作为活性检测的粗提取物.2.2.4菌株筛选as1.4以枯草芽孢杆菌CMCC(B)63003(Bacillussubtilis,BS);金黄色葡萄球菌CMCC(B)26001(Staphylococcusaureus,SA);大肠杆菌CMCC(B)44102(Escherichiacoli,EC);根瘤土壤杆菌AS1.1416(Agrobacteriumtumefaciens,AT);酿酒酵母ACCC2.1882(Saccharomycescerevisia,SC)作为实验用敏感指示菌,用琼脂扩散法筛选活性菌株;粗提取物用甲醇溶解,配制成100mg·ml-1的溶液,吸取20μl加在灭菌烘干的滤纸片(直径为6mm)上,置于上层含有指示菌的双层营养琼脂固体平板中,甲醇作为阴性对照,青霉素、氯霉素纸片(上海医药化验所产)作为阳性对照.培养皿放于8℃冰箱中过夜,次日于37℃培养箱中培养24h观察结果,根据抑菌圈大小判别抑菌活性.2.2.5mtt法:具有细胞毒活性以肿瘤细胞Hela,BGC(中国科学院上海细胞研究所)作为目标细胞,培养基为含10%BCS的1640培养基,细胞毒活性测定采用MTT法,参照文献略有改动.细胞用胰酶消化后,调节密度为2～3×104个/孔,添加于96孔板中,每孔195μl,置于37℃、0.5%CO2培养箱中培养24h.粗提取物用甲醇溶解后加入培养板中,每孔样品浓度为200μg·ml-1,以甲醇作为阴性对照,37℃、0.5%CO2培养箱中培养48h.取出96孔板,每孔加入20μlMTT(5mg·ml-1),继续培养4h.弃培养液,每孔加入150μlDMSO,37℃振荡6min,492nm处测定各孔的光吸收,计算抑制率IR=(OD阴性对照-OD样品)/OD阴性对照×100%.IR≥50%判定为具有细胞毒活性.2.2.6细菌的鉴定对具有抗菌和细胞毒的海洋细菌进行菌种鉴定,G+菌采用Shewan海洋异养细菌鉴定系统,G-菌采用Oliver海洋细菌鉴定系统.3结果与分析3.1海洋细菌的抑菌能力根据采样海域及菌落形态、大小、色泽等特点,从海水、海泥及生物样品中共分离到341株海洋细菌.对5株敏感指示菌的抑菌实验表明,42株细菌具有至少抑制一种指示菌的活性(表1),其中4株对所有指示菌都有抑制作用,分别是真丛柳珊瑚(Euplexauracurvata)中分离到的NJ5-7-1、珍珠膜海绵(Hymeniacidonperleve)中分离到的NJ6-3-1、来源于青岛海水的QD1-2、来源于青岛石鳖的QD5-2-1.具有抑菌作用的海洋细菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)、发光杆菌属(Photobacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、交替单胞菌属(Alteromonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、屈桡杆菌属(Flexibacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)7个属,而大部分的活性菌株属于发光杆菌属(12株,28.6%)、假单胞菌属(10株,23.8%)、梭状芽孢杆菌属(6株,14.3%)、黄杆菌属(6株,14.3%)和交替单胞菌属(5株,11.9%).具有活性的海洋细菌对于指示菌表现出不同的抑菌谱(图1),42株海洋细菌中只有9%对EC有抑制作用,17%对SC有抑制作用,对SA有抑制作用的占52%,对BS有抑制作用的为69%,对AT有抑制作用的最多,占总数的81%.Lemos在实验中也发现海洋细菌很难对陆源病原菌EscherichiacoliATCC25922产生抑制作用;Ivanova筛选到的126株抗菌菌株中只有4株对E.coli的生长有抑制作用.造成这一现象的原因可能是革兰氏阴性菌的细胞外膜上具有狭窄的膜孔道蛋白,阻碍了极小亲水性抗生素类化合物进入细胞,而膜上的脂多糖成分也可降低亲脂性抗生素的穿膜扩散;Lewis则认为,在细菌中存在“抗药性泵”(Multidrugresistancepump)可将许多抗生素从胞内排出.这也是目前许多细菌抗药性的原因之一.3.2细胞毒活性测定在分离到的海洋细菌中有7株细菌的培养液粗提取物具有细胞毒活性(表2).QD1-2和NJ6-3-1除有抗菌活性外,对两种肿瘤细胞都有较高的细胞毒活性,IR值分别为65.0±0.9%和55.2±1.7%、60.2±2.6%和50.3±2.5%;具有抗菌活性菌株QD5-2-1和NJ6-3-2分别对两种肿瘤细胞中的一种有抑制作用.另外3株没有抗菌活性的细菌YTBM8-1A、QD7-1-1和NJ5-1-2B对Hela细胞有毒性作用.细菌分类表明这些活性菌株属于假单胞菌属、发光杆菌属、梭状芽孢杆菌属和肠杆菌科(Enterobacteriaceae).3.3海藻附生细菌活性分析从具有抗菌、细胞毒活性的海洋细菌数量和比例来看(表3),海水和海泥中所分离到的活性菌株分别为3株(5%)和2株(7%),远低于生物样品.虽然来源于无脊椎动物和来源于海藻的活性菌株数量一样多,但从比例来看,无脊椎动物达到22%,高于海藻的11%.在不同的海域,受到人为保护的南麂岛自然保护区所筛选到的活性细菌数量和比例(28株,16%)要高于山东的青岛和烟台(17株,10%)(表3,表4),其中南麂岛的珍珠膜海绵中筛选到8株活性细菌,是活性细菌来源最丰富的样品,其次是真丛柳珊瑚(6株)和链状节荚藻(6株).同前人的报道相似,Lemos在海藻附生细菌抗菌活性筛选工作中,发现17%的细菌对Staphylococcusaureus有抑制作用,对23株鱼类病原菌的75%也具有抗菌活性.Ivanova等从海洋无脊椎动物体表分离到491株海洋细菌,发现26%对海洋细菌、陆源细菌和真菌的生长有抑制作用.Burgess等对海藻和无脊椎动物这些防御体系较弱生物的体表寄生菌非常感兴趣,从这些生物表面筛选出400株细菌,发现35%的细菌有抗陆源病原菌活性,比从海水或土壤中筛选的高出许多.郑忠辉、黄耀坚等开展了包括厦门海区潮间带海洋动植物共、附生微生物的培养条件及其抗菌活性的研究,发现这些共、附生微生物具有相当高的抑菌比例.Armstrong认为,海洋生物附生微生物与宿主有着紧密的联系.它们一方面可以从其动植物宿主获得必需的各种.维生素、多糖、上中不饱和脂肪酸等营养,另一方面可以产生某些物质(如抗生素、毒素、抗病毒物质等),释放于水体中,以利于宿主生长代谢或增强宿主的抵抗能力.在本实验中,来源于无脊椎海洋生物和海藻的附生细菌具有相当高的活性细菌比例.这个结果证明了一些防御能力较差的动、植物能在海洋环境中存活,除了自身具有的生存机制外,其附生微生物也扮演着一定的保护性角色.4从海洋细菌活性物质中筛选出具有药物价值的化合物,并将其作为海洋药物的