锁阳不同溶剂提取物的提取研究

锁阳不同溶剂提取物的提取研究

锁阳是封闭科的肉桂枝，也被称为锁阳科。它具有两种食物用途。广泛分布于我国西北沙漠、戈壁和沙漠地区。研究表明:锁阳具有增强机体免疫、抗缺氧和抗氧化等生理活性。锁阳抗氧化活性的研究表明:锁阳粗多糖具有清除自由基的作用,锁阳提取物可提高抗氧化酶活性,清除羟基自由基和超氧阴离子作用。本文系统地研究锁阳不同溶剂提取物清除自由基活性,通过综合评价筛选出清除自由基活性的最佳提取物,并通过测定锁阳不同溶剂提取物中总黄酮含量,探索锁阳清除自由基活性的物质基础,为合理开发和有效利用锁阳资源提供了依据。经文献检索,未见相同研究报道。1材料和方法1.1锁阳科植物锁阳茎锁阳样品购自甘肃省人民医院药剂科,样品由中科院兰州化物所戚欢阳副研究员鉴定为锁阳科植物锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)的肉质茎。1.2仪器、药品和试剂SHA-B多功能恒温振荡器:江苏正基仪器有限公司;BT224S分析天平:Sartorius;CH-8606微量分析天平:Mettler-Toledo;DZF-6050真空干燥箱:巩义市英峪予华仪器厂;RE-52CS-2旋转蒸发器:巩义市予华仪器有限公司;T6新世纪紫外-紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限公司。1,1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)标准品:Sigma公司,批号为S43654-098;儿茶素、芦丁对照品:中国药品生物制品检验所,批号分别为100080-200306、877-200001;双重蒸馏水:实验室自制;其他试剂:分析纯。1.3各种溶剂提取自锁阳，dpph活性测定1.3.1锁阳溶剂提取液的制备将阴干的锁阳肉质茎粉碎后过26目筛,精密称取一定量的锁阳粉末,按1g∶20mL加入不同提取溶剂(水、pH3水、60%乙醇、95%乙醇、水饱和正丁醇、正丁醇、乙酸乙酯),在恒温振荡器上室温振摇6h,过滤,得锁阳不同溶剂提取液。分别在40℃(95%乙醇、乙酸乙酯提取液)和75℃(水、pH3水、60%乙醇、正丁醇和水饱和正丁醇提取液)下,在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干时,用少量溶剂转移到蒸发皿中,经真空干燥(50℃、-0.08MPa)得锁阳不同溶剂提取物,低温保存备用。1.3.2提取溶剂的确定精密称取标准品DPPH·约12mg,用甲醇定容至250mL,即得DPPH·标准储备液(119.7μmol/L),低温保存。临用时将储备液稀释至59.85μmol/L的工作溶液。精密称取约25.0mg锁阳不同溶剂提取物,用相应的提取溶剂定容至25mL。精密吸取适量,用相应的提取溶剂稀释至浓度为0.2mg/mL的样品溶液。1.3.3确定最大吸收波长取1.3.2项制备的工作溶液,以甲醇做参比溶液,在分光光度计上400~900nm范围内扫描,确定最大吸收波长。分别精密吸取1.3.2项制备的样品溶液0.1mL,加入到3.9mLDPPH·工作溶液中,反应总体积为4.0mL,迅速振摇,在选定的最大吸收波长处,测定吸光度随时间的变化趋势,每60s取值一次,确定吸光度达到稳定水平所需时间。1.3.4dpph清除率分别取1.3.2项制备的标准品溶液和样品溶液,按照1.3.3项优化的条件测定,按公式(1)计算锁阳不同溶剂提取物样品溶液的自由基清除率。DPPH·清除率(%)=((AC-AS)/AC)×100(1)式中:AC为3.9mLDPPH·工作溶液与0.1mL甲醇混合后的吸光度;AS为3.9mLDPPH·溶液与0.1mL样品溶液反应达到稳定水平时的吸光度。1.3.5清除自由基活性的测定分别精密称取芦丁对照品、儿茶素对照品适量,用甲醇配制浓度为0.52、0.66mg/mL对照品溶液。精密称取提取物适量,用相应溶剂配制浓度为1.0mg/mL样品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液、样品溶液适量,依次用相应溶剂稀释成所需的各种浓度。分别精密吸取0.1mL不同浓度的上述溶液,加入到3.9mLDPPH·工作溶液中,在适宜的反应时间后测定吸光度,并按式(1)计算自由基清除率。以浓度与自由基清除率作图,求得清除50%DPPH·所需样品的浓度,即半抑制浓度IC50,比较锁阳提取物与儿茶素和芦丁清除DPPH·活性。1.4黄酮含量是通过锁阳不同溶剂提取的参照文献测定锁阳不同提取物中总黄酮含量。2结果与分析2.1索阳各种溶剂提取物提取物的提取率由表1可知,锁阳经不同溶剂提取的浸膏得率中,锁阳60%乙醇提取的浸膏得率最高,为50.23%。2.2dpph活性由不同的锁阳溶剂提取物决定2.2.1反应时间的确定经过波长扫描,选择517nm进行检测。分别在DPPH·甲醇溶液中加入0.2mg/mL的锁阳不同溶剂提取物样品溶液后,结果如图1所示。由图1可知,吸光度随时间延长而减小,但在10min内均达到稳定水平,故本方法确定反应时间为10min。其中,95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物到达反应完全所需时间较短。2.2.2清除dpph活性由表1可以看出,按照1.3.4项测定锁阳不同溶剂提取物清除DPPH·活性,由强到弱依次为:水饱和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。2.3最佳提取物筛选及dpph活性分析2.3.1乙醇提取物清除率及浸膏得率由表1可以看出,虽然水饱和正丁醇提取物清除率(38.70%)较60%乙醇提取物清除率略高(36.47%),但60%乙醇提取物浸膏得率(50.23%)远高于水饱和正丁醇提取物浸膏得率(8.83%)。经综合评价,60%乙醇提取物为锁阳清除自由基活性最佳提取物。2.3.2反应达到稳定水平的情况由图2可知,当60%乙醇提取物的浓度≤0.2mg/mL时,反应10min内达到稳定水平;而浓度增加到0.3mg/mL时,反应至15min才达到稳定水平时。60%乙醇提取浓度越大,吸光度到达稳定水平时,所需时间越长。2.3.3半抑制浓度试验由图3可知,按照1.3.5项得到60%乙醇提取物、芦丁、儿茶素对照品清除50%DPPH·的浓度,即半抑制浓度IC50分别为4.60、2.53、1.19mg/L。3带阳中dpph活性物质激活因素的研究天然产物中黄酮类化合物具有较强的清除自由基活性,为了阐明锁阳清除自由基活性的物质基础,分别测定锁阳不同溶剂提取物中总黄酮含量。3.1标准曲线和线性方程3.2其它有机溶剂提取物清除dpph活性的影响成分如表1所示,锁阳不同溶剂提取物清除DPPH·活性由强到弱依次为:水饱和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。相应的总黄酮含量由高到低依次为:水饱和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>水提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。除水提取物外,其他提取物清除DPPH·活性与相应的黄酮含量成正相关。水提取物清除DPPH·活性与其总黄酮含量的不对称,可能是由于水提物中的清除DPPH·活性物质除总黄酮外,还有活性多糖协同作用的结果。黄酮不易溶于酸性水,pH3水提取物总黄酮含量较低,清除自由基活性较水提取物差。水饱和正丁醇提取物、60%乙醇提取物当中的总黄酮含量较多,其清除DPPH·活性较强。乙酸乙酯为亲脂性溶剂,锁阳乙酸乙酯提取物中未检测到总黄酮,其清除DPPH·活性最弱。综上可知,锁阳清除DPPH·活性的物质基础与总黄酮具有密切关系。4不同有机溶剂提取的总黄酮含量对清除dpph活性的影响本文利用DPPH·法分别考察锁阳不同溶剂提取物清除DPPH·活性,并以提取物浸膏得率和DPPH·清除率为评价指标,筛选出最佳提取物为60%乙醇提取物。通过测定锁阳不