杠柳化学成分研究

杠柳化学成分研究

柳树是罗西亚科的一种藤蔓灌木，也被称为柳树科、柳树科和柳树科。主要分布在吉林、辽宁、河北、山西、陕西等北方地区,资源丰富。杠柳曾是我国民间使用的土农药,其根皮粉对白菜叶甲(Colaphellusbowringi)有一定的胃毒活性,对二十八星瓢虫(Epilachna28-maculate)具有胃毒和驱避作用,可毒杀豆蚜(Aphiscraccioora),杠柳的提取物对小菜蛾(Plutellaxylostella)幼虫有拒食和毒杀作用。杠柳中的化学成分主要有:杠柳毒甙、北五加皮甙、孕烯酮类、寡糖、4-甲氧基水杨醛、β-谷甾醇等。为了更好的利用杠柳这一宝贵杀虫植物,笔者在杀虫活性追踪指导下对杠柳根部杀虫活性成分进行研究,分离得到杀虫活性化合物LY01,LY01的结构经NMR鉴定为杠柳新甙A(PeriplocosidesA),即北五加皮甙A。1材料和方法1.1试验动物与仪器杠柳(PeriplocasepiumBunge)根部由延安市药材公司提供,自然阴干备用。供试昆虫为人工累代饲养的粘虫(Mythimnaseparata)3龄、6龄幼虫,由西北农林科技大学农药研究所养虫室提供。仪器与试剂:熔点使用X-4数字显微熔点仪测定(温度计未经校正),核磁共振谱使用BrukerAM-400核磁共振仪测定,CDCl3作溶剂,TMS作内标。硅胶为青岛海洋化工厂产品,其它溶剂未加特殊说明者均为市售分析纯。比旋光度由Perkin-Elmer241MC型自动旋光仪测定,CH3Cl为溶剂,20℃,589nm,高效液相色谱仪为日本岛津LC-6AD高效液相色谱仪。1.2方法1.2.1小麦叶片的处理采用浸叶饲虫法。将供试样品配成所需浓度的丙酮溶液,将0.5cm×0.5cm小麦叶片在药液中浸渍2s,对照在丙酮溶液中浸渍2s,待溶剂挥发后,将叶碟放入培养皿中,接1头饥饿12h的3龄幼虫,每样处理10头试虫,重复3次。24h、48h后检查结果,取平均值,计算死亡率和校正死亡率。1.2.2100死亡率(%)=(死亡虫数/供试虫数)×100;校正死亡率(%)=[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100。1.2.3试虫的处理将P-3样品配成5.0mg·mL-1的丙酮溶液,将0.5cm×0.5cm小麦苗叶片在药液中浸渍2s,对照在丙酮溶液中浸渍2s,待溶剂挥发后,将叶碟放入培养皿中,接1头饥饿12h的6龄幼虫,处理30头试虫,对照处理10头。4h、12h、24h后分别将出现症状的试虫及对照试虫用波因固定液(苦味酸∶甲醛=75∶25)固定,24h后解剖试虫。1.2.4昆虫活性测定将粉碎后的杠柳样品2.5kg用9000mL甲醇加热回流提取3h,过滤,滤渣重复用9000mL甲醇提取2次,合并提取液,回收溶剂后得浸膏353.0g。取部分样品进行杀虫活性测定。将352.0g浸膏加1200mL水悬浮,用1000mL氯仿萃取,重复3次。回收氯仿后得到氯仿萃取物92.5g,浓缩水相部分共得到120.7g。取部分样品进行杀虫活性测定。1.2.5化合物lya1135一级柱层析:称取90.0g氯仿萃取物,硅胶(100～200目)柱层析(80mm×1200mm),石油醚∶乙酸乙酯=10∶0～5∶5(V/V)梯度洗脱,每500mL收集1份。TLC检测,得到F-1、F-2、F-3、……,F-10洗脱物。杀虫活性测定后,活性段进行下一步柱层析分离。二级柱层析:称取30.0gF-9,硅胶(200～300目)柱层析(30mm×600mm),用石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮=1∶2∶3(V/V)的混合液淋洗,每100mL接收1份。TLC检测,得到7份:P-1、P-2、……,P-7洗脱物。杀虫活性测定后,活性段进行下一步分离。制备高效液相纯化:称取200.0mgP-3,用2mL氯仿溶解,进行高效液相色谱分离。得到化合物LY01(10.3mg)。进行杀虫活性测定。色谱条件:ShimadzuLC-6AD,具SPD-M10A二极管阵列检测器;HypersilODS2色谱柱(20×250mm,10μm);流动相:甲醇∶水=8∶2(V/V);流速3.0mL/min;柱温25℃;波长280nm;进样量200μL(浓度100mg·mL-1)。2结果与分析2.1部分试虫已感染时死亡试虫的症状杠柳根部的甲醇提取物及氯仿萃取物作用于试虫10h后,部分试虫出现中毒症状,随后,这些试虫在24h、48h后死亡。从表1中可以看出杠柳的甲醇提取物对粘虫有胃毒活性,氯仿萃取后活性增强,水相部分没有活性。2.2试虫的死亡时间一级柱层析各流分作用于试虫6h后,部分试虫出现中毒症状,随后,这些试虫在24h、48h后死亡。从表2可以看出F-7～F-10均有明显的杀虫活性,其中F-9杀虫活性最强,在5mg·mL-1浓度下,处理后24h死亡率即达到100%。2.3虫在24h、48h后死亡二级柱层析各馏分作用于试虫4h后,部分试虫出现中毒症状,随后,这些试虫在24h、48h后死亡。从表3中可以看出除P-1外,其它6个流分都有一定的杀虫活性,其中P-3杀虫活性最强,在5mg·mL-1浓度下,处理后24h、48h校正死亡率分别为83.33%和96.67%。2.4试虫的死亡试验高效液相色谱分离的化合物LY01作用于试虫4h后,部分试虫出现中毒症状。随后,这些试虫在24h、48h后死亡。从表4可以看出LY01是杠柳主要杀虫活性物质。2.5肠道结构及肉样的变化杠柳活性部分对粘虫作用后表现出特殊症状。经P-3样品浸叶饲喂法处理4h后,试虫被击倒,出现中毒症状。从图1A可以看出正常粘虫虫体粗细均匀,虫体可自由弯曲。图1B～E为中毒试虫,中毒后试虫明显腹部肿胀,不能弯曲亦不能爬行,但身体上部及头部可自由活动。图1D为症状出现初期,其腹足可正常伸缩,随着中毒时间延长,腹足不能正常伸缩,但用针刺激仍有反应。最终因肿胀加剧,试虫24h后死亡。解剖镜下观察试虫消化道及脂肪体,可见对照试虫消化道结构完整,轮廓清晰,中肠粗细均匀,中肠外围环肌排列整齐,消化道周围包绕的脂肪体呈明显的片状结构(图2的对照)。处理4h后,虫体中肠肿大,中肠肠壁变薄(图2的4h后);12h后,中肠肠壁破裂,肠道内容物外溢到体腔(图2的12h后)。死亡后的试虫,整个中肠及脂肪体被破坏殆尽(图2死亡)。推测可能是杠柳杀虫活性成分破坏了粘虫中肠细胞,致使血淋巴穿过肠壁细胞进入中肠,导致中肠肿胀,随着进入中肠的血液增多,肠壁破裂,中肠解体,试虫死亡。这种症状表现说明杠柳新苷A可能为昆虫消化毒剂。2.6糖苷的糖链和分子身份证的建立LY-01:白色粉末,m.p171-174℃(文献值;174～176℃);比旋光度[α]D20=-3.6°(C=1.21CHCl3){文献值;[α]D20=-1.2°(C=1.4CHCl3)}。13CNMR谱给出72个碳信号,结合DEPT谱可以看到LY-01含有8个季碳,33个CH,14个CH2,17个CH3。并且明显地看出169.4和185.8为2个羰基季碳的信号,147.8和140.3为2个双键上的季碳,121.9和118.4为2个双键上的CH,54.9,57.5,57.9,58.0,58.8,57.4为6个OMe的碳信号,在糖区表现典型的糖苷特征,98.4,99.3,99.6,100.3,102.4,113.7,76.98,77.35,77.60,77.64,78.33,79.24,68.09,68.15,68.47,68.89,69.84,70.02,70.42,70.99,81.62,82.54,82.54,82.65,86.3,显示多个糖上的碳信号,并且102.4,100.3,99.6,99.3,98.4,5个CH信号,86.3CH2,113.7季碳,表明形成糖苷的糖链由6个单糖组成,5个醛糖,1个酮糖。由1HNMR可以清楚看到3.40附近多个OMe中的质子信号,0.72,0.99两个连在季碳上的甲基,2.10一个乙酰基上的甲基。4.38,4.58,4.74,4.764.92,5.14显示多个糖异头炭上的质子信号。结合13CNMR和1HNMR谱,与文献报道的C72H114O27杠柳新苷A基本一致,故活性化合物LY01鉴定为杠柳新苷A。.13CNMR谱具体归属如下:甾体苷元:38.4(C-1),29.3(C-2),78.6(C-3),38.3(C-4),140.3(C-5),121.9(C-6),30.9(C-7),31.9(C-8),49.6(C-9),36.9(C-10),20.5(C-11),37.3(C-12),45.3(C-13),51.1(C-14),23.3(C-15),30.9(C-16),85.4(C-17),14.1(C-18),19.3(C-19),83.1(C-20),17.5(C-21),97.1(C-1′),185.8(C-2′),147.8(C-3′),118.4(C-4′),68.8(C-5′),22.9(C-6′),54.9(OMe)。糖链:Canaros:100.3(C-1),38.4(C-2),76.98(C-3),79.24(C-4),70.02(C-5),17.0(C-6);Heptulose86.3(C-1),113.7(C-2),36.9,(C-3),78.33(C-4),82.65(C-5),69.84(C-6),17.9(C-7);Cymarose1:98.4(C-1),36.8(C-2),77.64(C-3),82.54(C-4),68.89(C-5),18.2(C-6);Cymarose2:99.3(C-1),36.5(C-2),77.60(C-3),82.54(C-4),68.47(C-5),17.9(C-6);Cymarose3:99.6(C-1),35.9(C-2),77.35(C-3),83.66(C-4),68.15(C-5),18.2(C-6);Digitalose:102.4(C-1),70.99(C-2),81.62(C-3),68.09(C-4),70.42(C-5),16.4(C-6)。57.5,57.9,58.0,58.8,57.4分别为Cymarose,Digitalose,Heptulose上的OMe,169.4,20.9分别为Dig