颗粒污泥和悬浮填料生物膜的环境扫描电镜观察

颗粒污泥和悬浮填料生物膜的环境扫描电镜观察

作为废水生物处理的主要对象，生物膜的微生物群落分布、丰度和功能对处理系统的性能和稳定性起着重要作用。扫描电子显微镜（sem）是评价废水生物处理中微生物群落结构的重要手段之一。由于其图像清晰度的优点，它经常被用来研究污泥和生物膜的起源以及微生物群落结构。由于污泥和生物膜样品含水量高、导电性低，因此需要进行复杂的预处理，如固定、脱水、干燥和电离作用。这不仅需要很长时间，而且预处理过程中会导致样品收缩、损坏或损失，这不利于观察样品的真实面目。环境扫描电镜(ESEM)是在SEM基础上改进的一种新型电子显微镜.其采用多级压差光阑技术,形成梯度真空,即镜筒保持高真空的同时,样品室可维持高达2.66×102Pa的气压;样品室的温度、气压和相对湿度可以调节.其次,采用气体二次电子探测器,通过二次电子对气体分子的电离作用,一方面使生物样品微弱的二次电子信号放大,另一方面所产生的正离子可消除生物样品表面的电荷积累,可高倍数观察含水量高、导电性差的样品.因ESEM的可变压力腔替代了传统SEM的高真空腔,因此可不必对样品进行包括脱水、临界点干燥、镀金等传统处理,避免破坏其完整性.ESEM与SEM结合可为生物样品提供不同或者互补的形态结构信息.尽管ESEM是一种简单且无破坏性的分析方法,但由于技术的前沿性和高成本,目前国内外关于ESEM应用于水环境生物样品的报道还较少.本研究考察了废水生物处理中颗粒污泥和悬浮填料生物膜的ESEM观察条件,并与SEM进行比较,讨论了ESEM在废水生物处理系统中应用的优越性和局限性,为废水生物处理系统中微生物群落的研究提供支持.1材料和方法1.1温度调节装置厌氧颗粒污泥、好氧颗粒污泥和悬浮填料生物膜均取自本实验室废水生物处理反应器.Quanta200FEGESEM(荷兰FEI公司),带有冷台.样品台温度调节范围为-20~20℃,样品室气压调节范围0.13×102~2.60×103Pa.S-3400NIISEM(日本Hitachi公司).1.2实验方法1.2.1生物膜的制备用无菌离心管收集颗粒污泥和悬浮填料,用磷酸盐缓冲液充分漂洗;用滤纸吸去表面水分后,将切成小块的填料生物膜用导电胶粘于样品台上,选择不同温度、气压、湿度和加速电压确定适宜观察条件;颗粒污泥用4%戊二醛溶液固定,4℃放置过夜,用薄刀片切开颗粒污泥使横截面暴露,继续置于4%戊二醛溶液固定,4℃过夜,观察时将颗粒污泥粘于样品台上,选择温度、气压、湿度和加速电压确定适宜观察条件.1.2.2样品预处理将样品固定在2.5%戊二醛溶液中,4℃放置过夜.倒掉固定液,用1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)漂洗样品3次,每次15min.然后用依次用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液进行脱水处理,每次15~30min,再用100%乙醇溶液处理2次,临界点干燥.样品导电胶粘于样品台上,喷金镀膜后观察.2结果与讨论2.1生物样品形态结构的观察由图1a可见,样品表面水分较多时凝集的水滴会阻碍样品原始形貌的ESEM观察.观察时间>40min时,样品表面出现干瘪、脱水变形(图1b),甚至出现盐结晶体.因此对于含水量高、结构脆弱的样品,需要选择合适的温度、气压、湿度和加速电压观察生物样品的形态结构.参照文献报道,采用不同条件对样品进行观察,样品台温度0~5℃,样品室汽压5.91×102~7.88×102Pa,相对湿度75%~100%,加速电压8.00~15.00kV.实验结果表明,填料生物膜的适宜样品室条件为样品台温度5℃,样品室汽压5.91×102Pa相对湿度75%,加速电压8.00~15.00kV.颗粒污泥样品的适宜观察条件为样品台温度0℃,样品室汽压7.00×102Pa,相对湿度100%,加速电压10.00kV将样品固定于样品台之前,均需用滤纸吸去表面水分以防止样品表面水滴凝集影响观察.2.2生物膜微生物群落结构表征由样品1的ESEM照片(图2a,图2b)可见,各种形态的细菌附着在生物膜表面的胞外聚合物(EPS)上生长,致密的菌群层以各式各样的杆状菌和球状菌为主,同时生物膜内部供物质交流的孔洞和通道也清晰可见.低放大倍数的SEM照片显示生物膜上大量EPS的存在(图2c),高放大倍数照片隐约显现生物膜内部大量杆状和球状菌的附着生长(图2d).与样品1相比,样品2的ESEM照片直观显现了其生物膜以丝状菌为骨架,大量小球菌依靠EPS交联聚集在其周围(图3a),且在生物膜内部大量短杆状细菌以菌胶团形式附着在填料内壁上生长,正处于分裂期的细菌也清晰可见(图3b).SEM照片(图3c,图3d)仅显示生物膜表面分布较多的丝状菌,少量的杆状菌附着在填料内壁生长,更多的生物膜内部形态特征信息未能体现.由此可见,可能由于生物膜样品经过脱水和干燥处理后变形,较难在SEM中观察到其正常形态结构.由于喷金镀膜过程中的不均匀性,导使生物膜内部致密的菌群层导电性不佳,未能获得清晰的SEM照片.比较而言,未经任何处理的生物膜样品在合适的ESEM条件下得到的高放大倍数的清晰照片,能更真实的表征生物膜的微生物群落结构.2.3污泥不同内部形态观察由图4a,图4b可见,ESEM观察厌氧颗粒污泥表面较光滑,结构致密,表面菌群分布较为均匀,占主导地位的球状菌和短杆状菌聚集在颗粒污泥内层.由图4c,图4d可见,SEM观察到颗粒污泥呈扁椭圆形、表面以短杆菌为主要菌群,附着有少量球菌和丝状菌,存在较多空洞,这被认为是底物与营养物质的传递通道.污泥内部形态的SEM与ESEM观察结果类似.但ESEM观察时间大于20min时,发现厌氧颗粒污泥收缩变形影响观察效果,这可能与颗粒污泥是高密度微生物细胞活体的聚集体,含水量高,承受能力差,在高速电子束激发下易变形有很大关系.2.4sem结果分析ESEM观察(图5a)显示,好氧颗粒污泥表面较为光滑平整,而SEM照片则显示(图5b)其外观粗糙、结构致密、多处不规则突起.由此可见,SEM观察中样品进行脱水、干燥、镀金等处理导致了样品脱水变形,影响了真实形貌的观察.值得注意的是,ESEM观察时间大于5min时,同样发现好氧颗粒污泥在高速电子束激发下严重收缩变形,难以再得到清晰图片,其原因与厌氧颗粒污泥类似.2.5电子束前后含水量的变化废水处理中生物样品主要为颗粒污泥、絮状污泥及附着各类载体(活性碳、陶粒、膜丝、载网、填料等)生长的生物膜,如何利用ESEM真实显示其原始形貌主要存在2个问题.第1个问题是样品表面存在的水滴凝聚会影响观察效果.对于废水处理中的样品,在其表面均有不同程度的水分,需要用滤纸吸去,并且在相对湿度较低的情况下让其缓慢蒸发,然后在合适的相对湿度下观察,拍摄满意的图像.但对于不同样品而言,相对湿度低可能会引起不同程度的样品脱水,收缩变形(图1b),这需要耗费一定时间摸索最佳条件.另一个问题则是气压和入射电子束轰击可能会损坏含水量高、结构脆弱的样品表面形态.样品在ESEM中的承受能力与含水量及结构成分有密切联系.附着各类载体生长的生物膜吸去表面水分后,含水量不高,并且由于载体的支撑样品表面不易变形收缩,可以承受较长时间的观察.对于颗粒污泥这类含水量高、结构脆弱的样品,其承受能力差,易在气压和高速入射电子束的轰击下收缩变形,不易观察到真实形貌,则需要通过锇酸或者戊二醛等固定剂进行化学固定,使其产生交联作用、形成相对稳定的支架,不易受样品室环境条件影响,并且降低加速电压,尽量缩短观察时间,减少样品在高能入射电子束的轰击下变形、塌陷以至于影响观察效果,甚至无法得到原始形貌照片.,.ESEM可以观察不经任何处理的生物样品,更为真实地显现其原始形貌,与常规SEM结合可为样品形态结构分析提供新信息;含水样品经过脱水、干燥以及喷金导电处理往往严重变形,且絮状污泥体积小难以收集和处理,ESEM可避免由于人为操作造成对样品形态的破坏以及假象的产生;由于样品未经过固定和导电处理,ESEM结合能谱X射线元素分析(ESEM-EDX)可为样品的元素成分分析提供更精确的分析结果.总之,ESEM可观察未经任何处理的生物样品,这为水环境领域中生物样品的形态结构研究提供了新手段,具有广阔的应用前景.3不同条件对样品形貌的影响3.1ESEM观察悬浮填料生物膜的适宜观察条件为滤纸吸去样品表面水分,样品台温度5℃,样品室汽压5.91×102Pa,相对湿度75%,加速电压15.00kV;观察颗粒污泥样品的适宜条件为样品台温度0℃,样品室汽压7.00×102Pa,相对湿度100%,加速电压10.00kV.3.2未经任何处理的生物膜样品在合适的ESEM