重金属胁迫对灯心草生长及其生理生化特性的影响

重金属胁迫对灯心草生长及其生理生化特性的影响

随着农业生产的发展，重金属通过各种方式进入土壤。常见的如:矿山开采、污泥农用、废水灌溉、污染灰尘沉降等都将加重土壤重金属污染。土壤环境中的重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆的特点,通过迁移转化,经过食物链的积累和放大作用以后,将对生物产生更大的毒害作用。目前,在治理重金属污染土壤的众多方法中植物修复技术因其治理效果的永久性、治理过程的原位性、治理成本的低廉性、环境美学的兼容性、后期处理的简易性等特点,受到人们的普遍推崇。利用植物从污染土壤中提取重金属效率的高低取决于植物本身的属性。然而,目前发现的超累积植物往往植株矮小、生长速度慢,再加上受气候、土壤环境条件的限制,在实际应用中能够去除土壤污染元素的总量较小,因而作为土壤修复植物,具有较小的经济和应用价值。而一些普通植物虽然对重金属耐性低,组织中重金属累积量也不高,但由于其生长速度快、生物量大,在给定时期内带走的单位面积土壤中重金属总量也大,因而也具有极大的利用价值。对此,有人提出仅仅应用植物的生物富集系数和转运系数作为超累积植物的评价指标是远远不足的,还必须考虑植物的生长周期和生物量。即富集质量分数虽未达某一水平,但生长快、生物量大的植物也能作为超富集植物。对于重金属对植物的毒害方面研究者已经从形态、生理生化、细胞核分子水平作了大量的研究工作,主要集中在剂量效应关系的研究上,并从以前的高剂量、短期的急性毒性试验向低剂量、长期的慢性毒性试验转变的趋势。重金属污染下生物体抗性机理的研究一直是重金属污染生态学的重要内容之一。目前有关重金属污染对植物生态毒理效应的研究主要集中于陆生及水生植物,而对湿地植物的研究还涉及较少。灯芯草(Juncuseffuses)别名:野席草、灯草、水灯心,是席草类、莎草科蒲草属、多年生草本作物,在我国分布较广。灯心草以其经济、药用价值高而广泛应用于医药和民用工业,在利用其治理城市污水方面也有相关报道。Cd、Pb、Cu、Zn、As五种重金属元素可代表采矿及冶炼厂所排污水和大气的典型污染物,由其导致大面积的土壤污染给我国农业生产和人们身体健康造成了极大的不利影响。本次盆栽实验旨在研究Cd、Pb、Cu、Zn、As单一胁迫对灯心草生长及生理生化指标的影响,力求探明五种重金属对灯心草的生理毒害机制及设定在重金属污染区适合种植灯心草土壤中的各重金属临界毒性效应值,以期同时获得最佳的经济效益和生态效益,同时丰富环境污染生态学内容。1材料和方法1.1重金属添加量供试土壤采自湖南农业大学教学实习基地,为红壤性水稻土(其理化性质及重金属含量背景值见表1)。供试植物为典型的湿生植物—灯心草(Juncuseffuses),野外采集。各重金属添加形式:CdCl2·2.5H2O、Pb(NO3)2、CuCl2·2H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Na2HAsO4·7H2O均为分析纯试剂。陶瓷盆:直径为30cm高为20cm。1.2不同浓度重金属污染土壤元素和养分生物量供试土壤经自然风干、捣碎、剔除杂物后过2mm筛,同时测定其基本理化性质及重金属含量背景值。于每陶瓷盆中装土5kg,按预先设置的浓度(参照表2)于每盆中添加CdCl2·2.5H2O、Pb(NO3)2、CuCl2·2H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Na2HAsO4·7H2O等各外源重金属,同时按盆栽作物对养分的需求(即N200mgkg-1、P2O5100mgkg-1、K2O150～200mgkg-1),分别加入尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾400、200、300mgkg-1,喷施清水充分混匀后平衡一周,作为模拟不同浓度的重金属污染土壤。向每盆中分别移栽野外采集的灯心草90株,并将每株在距土面2cm处剪断,待其重新生长。试验期间定期浇水,保持70%的田间持水量。生长40天后取植株相同部位茎叶,用蒸馏水洗净、揩干,用于测定各项生理生化指标。待其继续生长至120天后收获,沿土表剪取地上部,测量株高并观察记录其新增株数,同时洗出根系。在105℃下杀青半小时,70℃烘干,称量地上部和地下部干重。数据处理采用DPS3.01中文数据统计软件进行方差分析和多重比较。1.3抗氧化酶活性的测定灯心草叶绿素总含量(叶绿素a+叶绿素b)的测定:丙酮和乙醇浸提法,分别在波长644nm和662nm处用分光光度法测定。SOD活性的测定:化学比色法。按照从南京建成生物工程研究所所购买的试剂盒的顺序测定(Uml-1·FW)。CAT活性的测定:分光光度法,按照从南京建成生物工程研究所所购买的试剂盒的顺序测定(Uml-1FW)。POD活性的测定:愈创木酚法(470nmmin-1g-1FW)。试验结果为3次结果平均值。数据处理采用Origin6.1工具软件作图进行分析。2分析与讨论的结果2.1单一重金属胁迫对灯心草生长指标的影响Cd、Pb、Cu、Zn、As单一重金属胁迫在试验条件下对灯心草各项生长指标的比较列于表3。表中结果为三次重复的平均值。通过方差分析和多重比较可以区分出添加的重金属元素对植物生长的综合影响差异。2.1.1单一重金属胁迫对灯心草新增株数的影响从表3可以看出,在土壤环境质量二级标准范围内,Cd、Pb、Cu单一处理对灯心草的新增株数有一定的促进作用(处理水平2、3、6、7、10、11)。在三者胁迫下灯心草新增株数均高于对照且随着各重金属处理浓度的增大而增加。但当浓度超过此范围后,其新增株数随重金属处理浓度进一步增加而显著减少(在水平4处的Cd处理除外)。当在Zn、As单一处理条件下时,灯心草新增株数均少于对照,并随着各自浓度的增加而呈现出不同的变化趋势。Zn处理时随着处理浓度的增加其新增株数呈现下降趋势;As处理时随着处理浓度的增加其新增株数呈现先升后降的趋势。从新增株数与对照相比而言,各单一重金属对灯心草新增株数的促进程度大小排序为:Cd>Pb>Cu>As>Zn。2.1.2单一重金属胁迫对灯心草株高的影响由表3可知,除了在土壤环境质量二级标准范围内Cd、Pb单一处理下(处理水平2、3、6、7)的灯心草株高比对照大外,其它各处理水平下的株高均低于对照,差异性显著(P>0.5)。且在Cd、Pb、Cu、Zn、As单一胁迫下灯心草株高随着各处理元素浓度的增加而呈现出的变化趋势与新增株数的变化趋势相一致,随着Cd、Pb、As处理浓度的增加其株高呈先升后降的趋势;随着Cu、Zn处理浓度的增加其株高呈下降的趋势。2.1.3单一重金属胁迫对灯心草地上部干重的影响土壤元素的临界含量(土壤元素环境质量基准)是制订土壤环境质量标准的基础。作为制订土壤环境质量基准方法之一的生态环境效应法是基于土壤一植物体系、土壤一微生物体系、土壤一水体系或其中任何一种体系的环境质量标准推算土壤中重金属元素的最高允许浓度。应用生态环境效应法得出的土壤环境质量基准值是有害物质在土壤中有所积累,但对农作物和环境尚没有造成危害和污染。为此,国家土壤环境容量协作组于1991年制定了以作物产量为依据来确定土壤临界含量的方法。依据规定将植物生物量或产量减少5%～10%(灯心草产量数额小取高限)土壤有害物质的浓度作为土壤有害物质的最大允许浓度。由表3可见,当土壤中Cd含量分别为0.3mgkg-1、1mgkg-1和10mgkg-1时与对照灯心草地上部干重相比较,均表现出增产趋势,其增产的幅度为10.73%～54.30%;但在Cd含量为20mgkg-1时,灯心草地上部干重比对照减少了26.79%>10%。由此可见,当土壤中Cd浓度在土壤环境质量二级标准范围内时,灯心草地上部产量呈现出上升趋势,说明在此浓度范围内的Cd浓度促进了灯心草的生长。但超出此浓度范围后,重金属Cd将显著地抑制灯心草的生长。因此,可以将土壤中Cd的临界值设定为10mgkg-1或稍高于此值。对于Pb处理,在土壤环境质量二级标准浓度范围内与对照灯心草地上部干重相比较,均表现出增产趋势,在超过该浓度范围后则开始减产,其减产幅度为14.38%～30.25%>10%。据此,可以将Pb的土壤环境质量二级标准上限值设定为适合种植灯心草土壤中Pb的临界值。在重金属Cu和Zn处理下,灯心草地上部干重均随重金属浓度的升高而递减,除Cu处理在50mgkg-1时高于对照外,其余处理均低于对照。但Cu处理在为100mgkg-1时降幅为4.14%<10%。因此,可以将土壤中Cu的临界含量设定为100mgkg-1。而在Zn处理下灯心草地上部干重最大值仅为14.30mgkg-1,相对于对照减产幅度为31.22%>10%,由此可认为灯心草不适宜在Zn污染土壤上种植。对于As处理,灯心草地上部干重则表现出与重金属Cd处理类似的变化趋势:随着重金属处理浓度的增加其地上部干重均呈上升趋势,且最大值所对应的重金属含量均超出了土壤环境质量二级标准。但与Cd处理不同的是As处理虽然在40mgkg-1时灯心草地上部干重达到最大,高于对照,但当土壤中As含量低于或高于此值时灯心草地上部干重均比对照低。因此,对于适合种植灯心草的土壤中As含量的临界值尚需做进一步的研究予以确定。通过比较分析各重金属及其各处理水平对灯心草新增株数、株高和地上部干重的影响,可见对新增株数、株高和地上部干重的影响趋势是一致的,由此可以断定单一重金属胁迫对灯心草地上部干重的影响主要是通过影响其新增株数和株高造成的,这对于应用灯心草修复重金属污染土壤具有现实的指导意义。2.1.4单一重金属胁迫对灯心草地下部干重的影响由表3可以看出,不同重金属胁迫对灯心草地下部干重的影响存在一定的元素种类差异。当土壤中Cd含量为0.3～1mgkg-1、Pb含量为100mgkg-1、Cu含量为50mgkg-1时灯心草地下部干重均高于对照,其增产幅度为3.43%～31.86%。而其它各浓度处理水平的地下部干重均低于对照。与单一重金属对灯心草地上部干重的影响相比较,影响的趋势基本上一致,但从多重比较分析来看其影响程度相对较小。可见灯心草地下部对重金属的抗性要大于地上部,这种特性对于利用灯心草进行土壤重金属污染区的植被重建、固土和固沙蓄水提供了科学根据。2.2单环重金属胁迫对照明草生理生化指标的影响2.2.1pb对灯心草叶绿素总含量的影响由图1可以看出,不同单一重金属胁迫对灯心草叶绿素总含量均表现为不同程度的抑制作用且随着其处理浓度水平的增高分别呈现不同的特征影响趋势。总体而言,在五种重金属单一胁迫下,灯心草叶绿素总含量都明显低于对照,达到了极显著程度。具体来看,主要表现为两种变化趋势:(1)随着Pb处理浓度梯度的增高,灯心草叶绿素总含量呈平缓下降的趋势。(2)随着Zn、Cu、Cd、As处理浓度梯度的增高,灯心草叶绿素总含量呈先降后升再降的趋势。由表1还可以。2.2.2植物pod活性有关POD许多研究表明,在重金属胁迫下,植物叶片的POD活性表现为增强。由图2可以看出随着Zn、Cu、Cd三种重金属处理浓度的增加,灯心草POD活性呈现先降后升的趋势。Zn、Cu胁迫下POD抗性高峰均出现在处理水平3,分别比对照上升了25.09%和8.42%。Cd胁迫下POD抗性高峰出现在处理水平4,比对照上升了16.67%。而Pb、As则呈现先升后降再升的趋势,其抗性高峰均出现在处理水平1,分别比对照上升了29.46%和18.52%。由图2还可以看出Zn在其高浓度处理水平4时灯心草POD活性表现为突然下降,低于对照18.86%。这表明随着Zn处理浓度的进一步增加,在植物体内产生的有毒物质超过了POD正常的催化能力后则导致其活性的下降,其后果是使植物体内H2O2过量积累,进而对植物体内的膜系统造成潜在的氧伤害。由此可以看出Zn对灯心草POD活性的影响要大于其他几种重金属,这与Zn对灯心草叶绿素总含量的影响趋势基本一致。2.2.3重金属胁迫对植物sod活性的影响由图3可以看出不同重金属对灯心草SOD活性的影响不同。在Pb和Cu单一胁迫下灯心草SOD活性呈先升后降的趋势,Cd和As呈现先降后升的趋势,而Zn则呈急剧下降趋势。许多研究表明,SOD作为超氧自由基清除剂,其活性高低与植物抗逆性大小有一定相关性,在适度逆境诱导下,SOD活性增加以提高植物的适应能力关于重金属胁迫下植物体内SOD活性的变化。就目前的研究来看有两种情况:一是SOD活性随重金属浓度的增加而增加;二是随着重金属浓度的增加,SOD活性先上升后下降。由此看来而在Cd、As两种重金属胁迫下灯心草SOD活性变化趋势基本与前者相似,而在Pb、Cu、Zn三种重金属胁迫下灯心草SOD活性变化趋势基本与后者相似。从Cd、As胁迫对灯心草SOD活性变化趋势线可以看出,与其它三种重金属相比Cd、As在其高浓度处理水平4处(其中Pb、Cu、Zn均为土壤环境质量三级标准上限值,Cd、As则超过了土壤环境质量3级标准),灯心草SOD活性不仅未降低,且有激活趋势,分别比对照高出了1.68%和4.40%。而灯心草SOD活性在Pb、Cu、Zn三种重金属胁迫下的变化趋势与POD大体相同,在高浓度处理水平4处均达到了最低值,分别比对照下降了33.07%、25.69%和36.53%。这就表明Cd、As单一胁迫对灯心草SOD活性的影响要明显小于其它三种重金属,也可以在某种程度上推断SOD酶在灯心草抗Cd、As单一胁迫中起一定的作用。2.2.4重金属胁迫对灯心草cat活性的影响图4结果显示了不同浓度重金属单一胁迫下,灯心草CAT活性的变化情况。从图4中可以看出,随着Zn、Cd、Cu、As处理浓度的增高,灯心草CAT活性呈先升后降的趋势。低浓度重金属胁迫对CAT活性有一定的激发作用,但随着处理浓度的增高其活性逐渐被抑制。其中在Zn、As胁迫下酶活性下降最为显著,在高浓度处理水平4时酶活性均低于对照,分别为对照的62.64%和34.58%。从图4还可以看出与前四种重金属表现出来的趋势相反,灯心草CAT活性随着Pb处理浓度的增高呈先降后升的趋势。在低浓度时酶活性遭到抑制,而在高浓度时被激活。植物生理研究表明CAT是植物体内一种重要的氧化还原酶,可以清除植物通过呼吸代谢或者光合作用等途径产生的H2O2、清除植物体内过多的活性氧、维持活性氧代谢的平衡、保护细胞膜的完整性。它是生物氧化过程一系列抗氧化酶的终端,逆境因子对生物生理的影响,可以通过终端酶CAT表现出来。在本研究中出现CAT活性随重金属浓度增高呈先上升后下降这一现象的原因可能是当植物处于较低浓度的重金属胁迫时,体内产生较多H2O2,作为一种机体自卫反应,CAT活性上升可以提高植物清除H2O2的能力,从而在一定程度上缓解H2O2积累对细胞的破坏。但是,随着重金属胁迫浓度的增加,超过植物所能忍受的极限时,作为防御体系的酶的活性也相应减弱。图4显示CAT酶在Pb胁迫下亦表现与SOD酶在Cd、As胁迫下类似的变化趋势。在Pb胁迫下植株有提高其CAT活性的作用,并有随着铅浓度增大而使CAT活性增大的趋势。在高浓度重金属胁迫下,灯心草的酶活性被激活的现象有可能是灯心草在受外界不良因素干扰达到一定的程度下所表现出来的一种应激反应,进而表明其对相应重金属胁迫的抗性较强。这对利用灯心草治理重金属污染土壤具有极大的现实意义。3重金属胁迫对灯心草叶绿素含量的影响(1)以灯心草生物量为参考指标,根据生态环境效应法可以将种植灯心草的土壤中Cd、Pb、Cu三种重金属临界值分别设定为10mgkg-1、100mgkg-1、100mgkg-1。灯心草不适合在Zn污染的土壤中种植,土壤中As临界值则尚需作进一步的研究来确定。(2)各单一重金属胁迫对灯心草叶绿素的合成均有极大程度的抑制作用,剂量-效应关系明显。但在不同重金属胁迫下灯心草叶绿素总含量下降的具体变化趋势存在差异。灯心草的三种保护酶对于不同浓度重金属胁迫的响应程度不同。在接近土壤环境质量标准低浓度范围内三种酶有较好的协同效应能共同抵御重金属胁迫造成的膜伤害,表现出较强的自我调节能力。而在高浓度处理水平时,针对不同重金属胁迫,三种