超声波辅助乙醇法提取锁阳多糖的研究

超声波辅助乙醇法提取锁阳多糖的研究

锁阳是一种稀有而珍贵的中药。俗称“不老药”,又名铁棒槌、锈铁棒、地毛球、乌兰高腰(蒙语),是锁阳科锁阳属的单科单属单种植物。锁阳可食用,目前开发的产品有锁阳保健酒、锁阳啤酒、锁阳饮料、锁阳冲剂、锁阳胶囊、锁阳精、锁阳茶和锁阳饮片等。锁阳含多种化学成分及药用成分,含有有机酸、黄酮类、甾体类、三萜类、氨基酸、熊果酸、鞣质、多糖、无机离子等成分。锁阳具有抗肿瘤、降低血糖、抗辐射、调血脂等作用,锁阳多糖能促进细胞再生和新陈代谢,增强免疫调节能力,具有防癌、抗病毒、延缓衰老和疲劳的作用。多糖的提取方法主要有大孔树脂吸附法、酶法提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和超临界萃取法等。采用超声波和醇溶液共同作用可提高多糖提取率。目前研究的报告中有关锁阳多糖的提取有水法提取和超声水提取法,有关超声辅助醇法提取锁阳多糖未见报道。本试验以锁阳为原料,以料液比、乙醇浓度、超声时间、超声功率为因素,锁阳多糖含量为指标,采用超声法辅助醇法提取锁阳多糖,通过单因素、正交试验,确定最佳提取工艺,为锁阳多糖的进一步利用提供试验基础和科学依据。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1材料和试剂锁阳:产地甘肃省张掖市平山湖;葡萄糖、乙醇、苯酚、浓硫酸:分析纯,国药化学试剂有限公司。1.1.2仪器、仪器和体制紫外可见分光光度计:T6新世纪型,普析通用仪器有限公司;旋转蒸发器:Laborota4000efficient型,德国海道尔夫公司;台式高速离心机:H1650型,湘仪离心机仪器有限公司;多用途恒温超声提取器:SY-1000E型,北京弘详隆生物技术开发有限公司;电热恒温鼓风干燥箱:HPG-9145型,北京东联哈尔滨仪器制造有限公司。1.2方法1.2.1粗多糖含量测定锁阳→破碎→超声醇提取→过滤→减压浓缩→离心→减压浓缩→干燥→锁阳多糖粗品超声提取后,提取液经减压浓缩至约80mL,加80%的等量乙醇,静置过夜,4000r/min离心15min,过滤,沉淀用无水乙醇洗涤2次,经室温真空(-60kPa)干燥得锁阳粗多糖,按原料重计算粗多糖得率。(2)标准曲线制作:精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25mg,置于250mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,配成0.1mg/mL的标准溶液。分别移取上述标准溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mL,依次加水使最终体积为1.0mL,另取1.0mL蒸馏水作为空白。每一试管中加入1.0mL5%苯酚溶液,混匀,迅速加入5.0mL浓硫酸,振摇5min后放置35min,在最大吸收波长490nm处测定吸光度。(3)测定方法:苯酚-硫酸法。锁阳中粗多糖经苯酚-硫酸处理后,得到橙黄色溶液,在波长490nm处采用比色法,以葡萄糖为标准品测定多糖含量。取粗多糖样品0.05g用蒸馏水溶解,配制成0.05mg/mL样品溶液。取2mL样品,采用苯酚-硫酸法,计算锁阳多糖含量。1.2.2酶活剂的提取(1)料液比对多糖含量的影响:准确称取5g锁阳干粉,超声功率为700W,萃取时间为90min,萃取温度为80℃,乙醇浓度70%,采用6个液料比(1∶5,1∶10,1∶20,1∶30,1∶35,1∶40(m∶V))提取锁阳多糖。(2)乙醇浓度对多糖含量的影响:准确称取5g锁阳干粉,超声功率为700W,萃取时间为90min,萃取温度为80℃,料液比1∶10(m∶V),采用6个乙醇浓度(60%,70%,80%,90%,95%,100%)提取锁阳多糖。(3)超声时间对多糖含量的影响:准确称取5g锁阳干粉,超声功率为700W,萃取温度为80℃,料液比1∶10(m∶V),乙醇浓度70%,采用6个萃取时间(30,60,90,120,150,180min)提取锁阳多糖。(4)超声功率对多糖含量的影响:准确称取5g锁阳干粉,萃取温度为80℃,料液比1∶10(m∶V),乙醇浓度70%,萃取时间90min,采用6个萃取功率(600,700,800,900,950,1000W)提取锁阳多糖。1.2.3正交优化设计试验1.2.4重复试验在正交试验中选出最佳提取工艺,进行多次重复实验,取平均值,并对实验结果进行相对平均偏差和相对标准偏差分析,检测提取方法的重现性。2结果与分析2.1标准曲线和回归方程根据试验测定结果,绘制出葡萄糖标准曲线见图1,得回归方程:A——吸光度;x——葡萄糖浓度,mg/mL。2.2单因素试验的结果2.2.1阳多糖含量的测定由图2可知,料液比在1∶30(m∶V)时,锁阳多糖的含量最大。随着料液比增大,加大了过滤、浓缩过程,造成一定量的多糖损失,料液比在1∶30(m∶V)以上时,锁阳多糖的含量无明显变化。2.2.2含量最大的含量由图3可知,乙醇浓度在80%时,锁阳多糖含量最大;随着乙醇浓度的提高,少量多糖在乙醇溶液中的溶解度下降析出,过滤、离心操作时沉淀下来,造成多糖含量有一定量的减少。2.2.3超声时间对nd-ld-l由图4可知,超声时间在90min时,锁阳多糖的含量最大,当超声时间为120min以上时,一少部分多糖降解分解,多糖含量呈现下降趋势。2.2.4超声功率对多糖含量的影响由图5可知,超声功率在600~900W时,提取率随着超声功率的增大而增加,当超声功率为900W以上时,超声波的机械剪切作用能使的大分子结构断裂,造成提取液中一少部分多糖发生降解,随着超声功率进一步增大,多糖含量有减少的趋势。2.3正交试验结果在单因素试验基础上,设计以料液比、乙醇浓度、超声时间、超声功率为四因素三水平的正交试验,因素水平见表1。正交试验结果见表2,方差分析见表3。由表2可知,影响锁阳多糖提取工艺的主次顺序为料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率,最佳提取工艺为A1B2C2D2,即料液比1∶10(m∶V),乙醇浓度80%,提取时间1.5h,超声功率800W。在此组合下,锁阳多糖的含量达到45.18%由表3可知,料液比对锁阳多糖提取影响显著。2.4试验重现性试验在优化条件下进行重复性试验,结果见表4,锁阳多糖平均含量为45.07%,相对平均偏差为0.35%,相对标准偏差为0.43%,都小于5%,表明试验重现性较好。3多次实验验证本试验表明,影响提取率的先后顺序是料液比>提取时间>乙醇浓度>超声功率;最佳提取条件为料液比1∶10(m∶V),乙醇浓