hplc法测定锁阳中原儿茶酸的含量

hplc法测定锁阳中原儿茶酸的含量

锁阳又名不老药、锈铁棒、地毛球和羊圈拉。这是锁阳科植物锁阳的干燥土壤。具有益肾阳、益血润肠排便的功效。临床上主要用于腰膝酸软、阳虚、滑精、肠干渴等证候，疗效准确。锁阳中含有的原儿茶酸,具有增加冠脉流量、降低心肌耗氧量、体外抑制血小板聚集和抗菌的活性[3~5]。锁阳及其制剂中原儿茶酸的含量测定尚未见文献报道。本文以原儿茶酸为对照品,建立了以高效液相色谱(HPLC)法测定锁阳药材中原儿茶酸含量的方法,结果准确、重现性好,可为控制该药材和饮片的内在质量提供参考依据。1材料表面1.1高效液相色谱仪检测d-20001100高效液相色谱仪,包括G1311A四元泵、G1315ADAD检测器、1100化学工作站(美国Agilent公司);高效液相色谱仪,包括L-6000泵、L-4200H检测器、D-2500数据处理机(日本日立公司);D2025型十万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司);SB2200-T超声波提取器(上海必能信超声有限公司)。1.2测定试剂及仪器原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:809-200102);乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯;锁阳药材由甘肃省张掖市药品检验所毛晓春副主任药师鉴定为CynomoriumsongaricumRupr.。2方法和结果2.1理论塔板数测定色谱柱:LichrosorbODSC18(250mm×4.6mm,5m);流动相:乙腈-水-冰醋酸(10∶100∶0.1);检测波长:259nm;流速:1.0mL·min-1;柱温:室温;进样量:10μL。理论塔板数按原儿茶酸峰计算约为6400。在此色谱条件下,原儿茶酸和前后色谱峰可达到基线分离,拖尾因子为1.06,峰形基本对称,详见图1。2.2对照品贮备溶液精密称定原儿茶酸对照品9.10mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,作为对照品贮备溶液;精密吸取上述对照品贮备溶液5mL,置25mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,作为对照品溶液(每1mL含原儿茶酸36.4μg)。2.3水浴浓缩提取液制备取样品粉末(过3号筛)约1g,精密称定,加水50mL回流提取2次每次1合并提取液水浴浓缩至约10加盐酸调节pH值为3,置分液漏斗中,用乙醚轻轻振摇提取4次(25、25、25、20mL),合并提取液,低温挥干乙醚,残渣用流动相洗至10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,备用。2.4标准曲线及线性回归法考察对照品进样量与峰面积积分值精密吸取上述对照品贮备溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL(分别含原儿茶酸0.364、0.728、1.092、1.456、1.820mg),分别置于25mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温。精密吸取上述5种溶液各10μL,按上述色谱条件,分别进样,测定。以对照品进样量(X,μg)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程:Y=1064644.9X+2584.3(r=0.9999)。结果表明,原儿茶酸进样量在0.15~0.73μg范围内具有良好的线性关系。2.5精密度测试精密吸取对照品溶液,在上述色谱条件下连续进样6次。结果,原儿茶酸峰面积的RSD=0.55%,表明本方法精密度良好。2.6份3.9的测定取同一批样品(产地:内蒙古阿右旗)6份,按“2.9”项下方法测定。结果,平均含量为0.24mg·g-1,RSD=0.29%,表明本方法重现性好。2.7h内平均含量取“2.6”项下同批样品在4、8、12、24、48h分别测定。结果,24h内平均含量为0.23mg·g-1,RSD=0.38%;48h内平均含量为0.23mg·g-1,RSD=0.56%,表明被测样品在48h内稳定性良好。2.8对照品溶液的制备取已知含量的样品(产地:内蒙古阿右旗,含量:0.24mg·g-1),共6份,每2份为一组,各加入一定量的对照品溶液,按上述方法制备供试品溶液,按“2.9”项下方法测定,结果详见表1。2.9锁阳药材和饮片中原儿茶酸含量测定照供试品溶液制备法制备10批供试品溶液,分别取对照品溶液、供试品溶液,经0.45μm针筒过滤器过滤,精密吸取10μL进样,按外标法计算,被测锁阳药材和饮片中原儿茶酸的含量测定结果详见表2。3样品含量测定在进行系统性试验时从检测器收集到的信息可知原儿茶酸在222、259、293nm波长处均有最大吸收,且在259nm波长处的灵敏度较高,故确定259nm为检测波长。在确定色谱分离条件时,笔者曾对甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等不同流动相进行多次选择比较,最终确定本文的检测条件,结果原儿茶酸能够达到基线分离、峰形好、保留时间相对适中、分离度较好,与甲醇-水-冰醋酸作流动相比较,柱压明显降低,其它成分无干扰。笔者曾将回流、超声、冷浸3种提取方法进行比较,结果回流方法可有效提取原儿茶酸,提取效率远远大于超声、冷浸提取法,故采用回流提取法。以甲醇-冰醋酸(100∶1)、30%乙醇-冰醋酸(100∶1)、50%乙醇-冰醋酸(100∶1)、0.1mol·L-1盐酸溶液、水等作为回流提取溶剂;以乙醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇(5∶1)作为萃取溶剂;并将提取时间、提取体积作为影响因素,对提取方法进行优选试验,最终确定本文采用水回流提取,以乙醚萃取,蒸干溶剂,加定量流动相溶解后进样的方法进行测定,结果可有效分离出原儿茶酸,减少了部分非测定物质的干扰。另外,对萃取次数的比较,选定萃取4次,结果表