GB 4789.6-2016 致泻大肠埃希氏菌检验 好

第四章：肠道致病杆菌检验

致泻大肠埃希氏菌检验/Publications/Currents/Archive/Mar-05-2004.html12016-12-23公布2017-6-23实施2GB4789.6-2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofDiarrheagenicEscherichiacoli第一部分前言1.概述2.生物学特性3.致病性6第二部分GB4.培养基和试剂5.检验程序6.毒素检测7.快速检测

1.概述

大肠埃希氏菌(Escherichia.coli;E.coli)，俗称大肠杆菌，是人类和动物肠道中正常菌群的主要成员，粪便约含109个/g。有益生菌、条件致病菌和致病菌三类。E.coli随粪便排出后，广泛分布于自然界。水、牛乳及其他食品或物品一旦检出大肠埃希氏菌，即意味着这些物品直接或间接被粪便污染。

72.生物学特性

1)形态与染色

2)培养特性3)生化特性

4）抵抗力

5）抗原性与分类

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91)形态与染色

G－、有鞭毛和菌毛、无芽孢或有荚膜，两端钝中小圆短杆菌。大小为(1.1－1.5)µmX(2.0－6.0)µm(活菌)或(0.4－0.7)µmX(1.0－3.0)µm(染色菌)，绝大多数菌株有周身鞭毛，能运动，周身还有菌毛，无芽孢，某些菌株具有荚膜。

2)培养特性

在普通培养基上：长成2－3mm的S型小菌落；

在鲜血琼脂平板上:生长，有些菌株可见β型溶血环**；

在麦康凯培养基上:因发酵乳糖而产生有色菌落；

在SS培养基上:大肠杆菌一般不能生长，少数生长的菌落也因发酵乳糖而呈红色；

在伊红美蓝琼脂平板上:生长成紫黑色带有金属光泽的菌落**；

在液体培养基中:呈均匀混浊生长，形成荚膜，管底有粘性沉淀培养物呈特殊的臭味。10**血液琼脂平板上的菌落周围溶血情况：

甲(α)型溶血：有草绿色溶血环乙(β)型溶血：呈透明溶血环

113)生化特性

大肠埃希氏菌发酵多种糖，，如葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速发酵乳糖，各菌株对蔗糖、水杨苷、卫矛醇及棉子糖的发酵力不一致，吲哚＋，MR＋，V－P－，枸橼酸胺盐－(IMVC++--)，尿素酶－，硫化氢－，氰化钾培养基中不生长，丙二酸盐利用－，可使谷氨酸和赖氨酸脱羧基，苯丙氨酸－，氧化酶－，接触酶＋。＋12

大肠埃希氏菌发酵多种糖，如葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；4）抵抗力

中等略强135）抗原性与分类大肠杆菌具有四种抗原：

O（菌体）抗原：173种H（鞭毛）抗原：60种K（荚膜）抗原：103种

F（菌毛）抗原：17种K抗原位于细胞壁外层，根据K抗原的物理性质又可分为L、A和B三种主要型别。几乎所有致病性大肠埃希氏菌都具有F（菌毛）抗原。表示大肠杆菌血清型的方式是O138：K88(B)：H12：

（F8

）。

。3致病性

(1)致病因素(2)所致疾病

(1)致病因素：①侵袭力②内毒素③肠毒素

①侵袭力大肠杆菌具有K抗原和菌毛：

K抗原：有抗吞噬作用，有抵抗抗体和补体的作用

菌毛：能帮助细菌粘附于粘膜表面。有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表皮层引起炎症。②内毒素大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性：其脂类A是毒性部位

特异多糖有助于细菌抵抗宿主的防御机制。14③肠毒素大肠埃希氏菌引起食物中毒的肠毒素有两种：

a.不耐热肠毒素(LT)：蛋白质，加热65℃经30min即被破坏，促进肠粘膜细胞大量分泌肠液,引起腹泻；常因生食所致。b.耐热肠毒素(ST)，ST无免疫性，耐热，100℃经10-20min不被破坏，它也可引起腹泻。15LT:heat

labileenterotoxinST:heatstableenterotoxin(2)所致疾病①肠外感染②腹泻

①肠外感染泌尿系统感染败血症胆囊炎肺炎新生儿或婴儿脑膜炎等。

16②腹泻

5类大肠杆菌都可引起腹泻：

产毒素大肠杆菌--是婴幼儿及旅游者腹泻的主要原因；

致病性大肠杆菌--是婴儿腹泻的主要原因，严重者可致死；

侵袭性大肠杆菌--主要引起较大儿童和成年人腹泻，有时甚至可引起爆发流行；

出血性大肠埃希氏菌O157--引起的主要临床症状是腹泻(重者水样腹泻)、腹痛、呕吐，是老幼患者死亡的主要原因。肠道集聚性大肠埃希氏菌：能引起肠道液体蓄积。17第二部分GB2016-12-23公布2017-6-23实施2GB4789.6-2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofDiarrheagenicEscherichiacoli前言本标准代替GB/T4789.6—2003《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》。本标准与GB/T4789.6—2003相比,主要变化如下:—标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验”;—增加了术语和定义、缩略语;—增加了血清学试验中H抗原鉴定;—增加了PCR确认试验;—增加了附录A;—修改了设备和材料;—修改了培养基和试剂;—修改了检验程序;—修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群;—删除了肠毒素试验。1范围本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenicEscherichiacoli)的检验方法。本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2术语和定义、缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1.1致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichiacoli一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括：2.1.2肠道致病性大肠埃希氏菌(

EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC）

2.1.3肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EnteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC）2.1.4产肠毒素大肠埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC）2.1.5产志贺毒素大肠埃希氏菌(

Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)

(肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)2.1.6肠道集聚性大肠埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)

2.2缩略语下列缩略语适用于本文件。2.2.1DEC:致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichiacoli2.2.2EPEC:肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichiacoli2.2.3EIEC:肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli2.2.4ETEC:产肠毒素大肠埃希氏菌EntertoxigenicEscherichiacoli2.2.5STEC:产志贺毒素大肠埃希氏菌ShigatoxinproducingEscherichiacoli2.2.6EHEC:肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli2.2.7EAEC:肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroaggregativeEscherichiacoli2.2.13lt:热不稳定性肠毒素基因,heat-labileenterotoxin2.2.14st:热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxin

（略）3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。~~~~~~

3.13接种环:1μL。3.14低温高速离心机:转速≥13000r/min,控温4℃~8℃。3.15微生物鉴定系统。3.16PCR仪。3.17微量移液器及吸头:0.5μL~2μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。3.18水平电泳仪:包括电源、电泳槽、制胶槽(长度>10cm)和梳子3.198联排管和8联排盖(平盖/凸盖)。3.20凝胶成像仪。

培养基和试剂4．1营养肉汤：4．2肠道菌增菌肉汤：

含牛胆盐、煌绿和葡萄糖4．3麦康凯琼脂：乳糖：发酵产酸；

中性红：指示剂，pH为6.8~8.0，酸色为红色，碱色为黄色。3号胆盐和结晶紫抑杂菌

E.coli产生有色菌落。18E.colionMacConkeyagar:positivelactosefermentation(hotpinkcolonies)andbileprecipitate(hotpink,opaqueagar)4．4伊红美蓝琼脂(EMB)：产生或带金属光泽的深紫色或紫红色菌落4．5三糖铁琼脂(TSI)：见附录A.5

205三糖铁琼脂(TSI)A.5.1成分：

蛋白胨20.0g

牛肉浸膏5.0g

乳糖10.0g+

蔗糖10.0gV

葡萄糖1.0g+

硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O]0.2g

氯化钠5.0g

硫代硫酸钠0.2gH2S—

酚红0.025gpH6.8-8：黄-红

琼脂12.0g

蒸馏水1000mL斜面糖发酵产酸或不产酸，底层产酸、产气；H2S—

4.6蛋白胨水、靛基质试剂

（＋）4.7半固体琼脂动力实验（＋）4.8尿素琼脂(pH7.2)尿素酶试验（－）4.9氰化钾(KCN)培养基：（－）4.10氧化酶试剂（－）可使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定4.11革兰氏染色液G-4.12BHI肉汤含小牛脑浸液和

牛心浸液250g；增加培养基的营养4.13福尔马林(含38%~40%甲醛)。4.14鉴定试剂盒。4.15大肠埃希氏菌诊断血清。4.16灭菌去离子水。

4.170.85%灭菌生理盐水。4.18~4.29：致泻大肠埃希氏菌PCR4.18=A.13TE(pH8.0)缓冲液含

Tris（三羟甲基氨基甲烷）-HCl(pH8.0)（缓冲液）和EDTA(pH8.0)：（核酸酶抑制剂），被用于DNA的稳定和储存。EDTA（乙二胺四乙酸）能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的一种螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂;也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。4.19=A.1410×PCR反应缓冲液4.20-4.23:催化剂、底物、Taq酶4.24=A.1550×TAE电泳缓冲液4.27=A.166×上样缓冲液

4.29致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒5.检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1检样：25g/25mL+营养肉汤225mLMCK和EMB琼脂肠道菌增菌肉汤PCR确认试验TSI，靛基质，尿素（pH7.2），KCN挑取乳糖发酵或不发酵的菌落10个以上TSI底层+，

H2S—，靛基质+，尿素（pH7.2）—，KCN—报告血清学试验36℃±1℃培养6h。取10μL,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内

42℃±1℃培养18h。划线接种36℃±1℃培养18h~24h是致泻E.coli(选做项目），玻片凝集或试管凝集试验。6.4.2TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸，靛基质阳性，H2S阴性，尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI斜面底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性。6.5PCR确认试验

6.5.1取菌落：取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验PCR确认试验。对PCR实验室有要求；6.5.2细菌基因组模板提取：有方法或用细菌基因组提取试剂盒；6.5.3设置对照：设阳性对照：每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株作为阳性对照。阴性对照：使用大肠埃希氏菌ATCC25922或等效标准菌株作为阴性对照；空白对照：用灭菌去离子水，控制PCR体系污染。6.5.4PCR反应体系配制：每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系,对应检测12个目标基因。6.5.5PCR循环条件：预变性94℃5min;变性94℃30s,复性63℃30s,延伸72℃1.5min,30个循环;72℃延伸5min。将配制完成的PCR反应管放入PCR仪中,核查PCR反应条件正确后,启动反应程序。6.5.6凝胶电泳：琼脂糖+溴化乙锭（EB）电泳，成像仪中观察结果，拍照并记录。6.5.7结果判定。电泳结果中空白对照应无条带出现；阴性对照仅有uidA条带扩增；阳性对照中出现所有目标条带；PCR试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小,判断目标条带的种类,记录每个泳道中目标条带的种类,在表5中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。6.5.8PCR试剂盒：如用商品化PCR试剂盒或多重聚合酶链反应(MPCR)试剂盒,应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。6.6血清学试验(选做项目)6.6.1取PCR试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验。6.6.2O抗原鉴定：凝集实验（用多管）假定试验和单管证实试验：用多价O抗血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O抗血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价O抗血清做凝集试验。

表6致泻大肠埃希氏菌主要的