脑胶质瘤患者o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶基因mgm及错配修复基因甲基化状态及其意义

脑胶质瘤患者o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶基因mgm及错配修复基因甲基化状态及其意义

恶意脑胶原瘤是一种常见的人类肿瘤之一。治疗方法已从单一的手术治疗转向手术、放疗和化疗等综合治疗，但恶意脑瘤患者的预后在过去几十年中没有显著改善。一些研究资料已经证实,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguananine-DNAmethyltransferase,MGMT)在脑胶质瘤组织中的表达与肿瘤的耐药性具有一定的关系,并可能影响患者的预后。另外,DNA错配修复(DNAmismatchrepair,MMR)系统与包括替莫唑胺在内的多种烷化剂药物发挥细胞毒性作用相关。hMLH1和hMSH2是最重要的2种MMR基因,其启动子甲基化可导致基因表达异常,但错配修复蛋白在烷化剂化疗中的作用目前还存有争议。我们应用甲基化特异性PCR(MSP)和免疫组织化学方法,分析了脑胶质瘤组织中上述3种基因启动子甲基化状态和蛋白表达,并利用患者的随访调查资料进行生存期分析,以探讨脑胶质瘤MGMT基因和错配修复基因启动子甲基化状态及其在肿瘤化疗中的意义。1材料和方法1.1病例选择和治疗39例脑胶质瘤肿瘤组织来源于2003年4月至2007年12月在解放军总医院第一附属医院和解放军第307医院治疗患者手术切除标本,新鲜组织样本切除后立即贮存于液氮中。患者男性18例,女性21例,年龄18～72岁,平均年龄40.6岁。所有患者均为原发性肿瘤,其中星形胶质细胞瘤11例,少枝胶质细胞瘤4例,少枝星形细胞瘤9例,多形性胶质母细胞瘤15例。病理分型和分级按WHO中枢神经系统肿瘤分类和分级标准,肿瘤Ⅰ～Ⅱ级16例,Ⅲ～Ⅳ级23例。患者均进行了开颅手术切除、术后常规放疗和尼莫司汀(ACNU)等烷化剂化疗等综合治疗,每3个月电话随访一次。6例正常组织来源于脑外伤及脑皮质造瘘患者。1.2脑胶质瘤新鲜冰激凌组织样本的提取用基因组DNA提取试剂盒(Promga公司)提取脑胶质瘤新鲜冰冻组织样本中的基因组DNA,操作步骤按说明书进行。抽提后用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测纯度及含量。1.3pcr扩增taq基因用DNA甲基化修饰试剂盒(EZDNAMethylation-goldKit)对上述抽提的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰(按试剂盒操作说明进行)。修饰后,甲基化的胞嘧啶(C)保持不变,而未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶(U),在随后的PCR反应中,被Taq酶读作胸腺嘧啶(T)。经过修饰的DNA样品分别以甲基化(M)和未甲基化(U)引物进行扩增,引物序列参照文献,由北京奥科生物技术有限责任公司合成。引物序列、退火温度及预期产物大小见表1。DNA扩增选用HotstartTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司),反应条件为:95℃5min,然后以95℃45s、各对引物相应退火温度45s、72℃60s进行35个循环,72℃延伸5min。以正常人外周血淋巴细胞(PBL)DNA作为未甲基化阳性对照,用甲基化酶(MSSsI)(NewEnglandBiolabs公司)处理的PBLDNA作为甲基化阳性对照,蒸馏水代替模板作为阴性对照。PCR产物用3.0%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,紫外光凝胶成像系统观察结果。1.4免疫组化染色组织标本经甲醛固定、石蜡包埋,MGMT、hMLH1和hMSH2的免疫组化染色采用DAB显色方法,MGMT、hMLH1和hMSH2均为鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物有限公司提供)。1.5基因甲基化状态与患者生存关系统计学分析用SPSS13.0forWindows软件完成,多样本均数比较采用单因素方差分析,2组均数比较采用单样本t检验,基因甲基化状态与患者生存期的关系用Kaplan-Merier生存曲线表示,并进行Log-rank检验。检验水准P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1基因甲基化检测结果MSP结果如图1所示,出现未甲基化条带(U)扩增,而不出现甲基化条带(M)扩增,判定为基因未甲基化;M和U条带均出现扩增,则判定为基因甲基化。在39例脑胶质瘤组织样本中,被检测出的MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%(18/39)、10.3%(4/39)和20.5%(8/39);6例正常样本中均未检测到相关基因启动子的甲基化。3种基因甲基化发生率与脑胶质瘤患者性别、年龄、疾病分型和病理分级均无明显相关性(P>0.05),结果见表2。2.2阳性细胞测定MGMT、hMLH1和hMSH2等3种抗体均为细胞核和细胞浆着色,在镜下细胞核、浆棕染且明显高于背景者为阳性,反之为阴性。阳性细胞<5%为阴性,<10%为弱阳性,10%～30%为阳性,<30%为强阳性,见图2。39例脑胶质瘤患者组织中MGMT、hMLH1和hMSH2蛋白表达阳性率分别为61.5%(25/39)、87.2%(34/39)和82.5%(32/39),脑胶质瘤组织中3种蛋白表达阳性率与相关基因未甲基化检出率明显相关(P<0.01,Fishers确切概率分析)。2.3脑胶质瘤患者memt基因甲基化的表达情况利用患者随访资料,针对MGMT基因甲基化状态绘制Kaplan-Merier生存曲线,并进行Log-rank检验分析。本研究中39例脑胶质瘤患者均进行了手术切除、放疗和烷化剂化疗等综合治疗,结果显示39例脑胶质瘤患者中MGMT基因甲基化组的中位生存期为26个月,而未甲基化组的中位生存期仅为16个月,经Log-rank检验有显著性差异(P<0.05),结果见图3。另外,MMR基因(hMLH1或hMSH2基因)甲基化的脑胶质瘤患者预后较差,中位生存期小于14个月。3启动子甲基化与mmr的关系MGMT作为一种DNA修复蛋白,能够移除DNA上鸟嘌呤O6位点的可致突变毒性和细胞毒性的烷基化加合物,使损伤的鸟嘌呤恢复,从而能够保护细胞对抗烷化基团的损害,是肿瘤耐受烷化剂药物的主要原因。MGMT在DNA修复蛋白中是很独特的,它以直接损伤逆转路径,只需一步反应就能将O6-AG上的烷化基团共价转移到自身的半胱氨酸残基活性位点上,使DNA上损伤的鸟嘌呤复原。这是一种自杀性反应,甲基化的MGMT失去活性,随后从DNA上释放下来,通过泛素化路径降解,而不能重新脱甲基化以恢复活性。这样,细胞克服O6-AG烷化损伤的生物学效应能力与MGMT分子数量直接相关。研究表明,MGMT基因启动子异常甲基化与MGMT蛋白缺失、mRNA表达缺失和MGMT活性缺失密切相关。近年来,与基因启动子甲基化有关的MGMT表观沉默取得较大进展,一方面,MGMT基因沉默可导致肿瘤相关基因转换突变的累积;另一方面,MGMT基因过甲基化还与肿瘤增强对烷化剂药物敏感性密切相关。MGMT甲基化具有预测人类肿瘤对烷化剂化疗药物反应性的潜在价值。人类的MMR系统由MutH、MutL和MutS等3大家族的蛋白组成,共6种修复蛋白,其中人MutS同源基因2(humanMutShomologoue2,hMSH2)参与识别DNA错配损伤,而人类MutL同源基因1(hMLH1)在错配修复中起中心作用,其他蛋白的作用均受它们的调节。Burgart检测了2000例散发的结肠癌标本,发现MMR突变率为15%左右,而hMLH1基因启动子CpG岛甲基化导致基因不表达是MMR缺陷的最主要原因(占所有突变的60%)。错配修复机制参与修复烷基化引起的碱基错配和DNA断裂等次级损伤,由于hMLH1和hMSH2在MMR信号系统中的重要作用,并且它们的缺陷占MMR系统缺陷的绝大多数,因此,hMLH1和hMSH2是除MGMT之外最重要的烷化剂耐受的分子标志。但MMR系统在烷化剂杀伤肿瘤细胞中的作用目前还未有定论,虽然多数研究者认为MMR能够识别烷化损伤引起的碱基错配,诱发细胞周期俘获和细胞凋亡,MMR功能缺陷会导致细胞对烷化剂耐受,但未经系统研究,因而有必要经过大量临床病例研究,确定MMR的作用。与其他研究者一样,我们在正常组织中没有检测到3种基因的甲基化,相反在脑胶质瘤患者肿瘤组织中,MGMT、hMLH1和hMSH2这3种基因中至少有1种基因的甲基化发生率为64.1%。其中MGMT基因甲基化发生率最高(46.2%),甲基化检出频率与文献报道相似;错配修复基因hMSH2甲基化发生率为20.5%,hMLH1基因甲基化发生率为10.5%,检出率比文献报道的要高。脑胶质瘤患者组织中MGMT、hMLH1和hMSH2蛋白表达阳性率与相关基因未甲基化检出率密切相关,表明在肿瘤组织中3种基因甲基化模式与蛋白表达模式相似,启动子甲基化在其蛋白表达调控中起着重要作用。另外,MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化发生率与脑胶质瘤患者性别、年龄、疾病分型和病理分级均无明显相关性(P>0.05),说明DNA修复基因MGMT及错配修复基因hMLH1和hMSH2的甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,可能与脑胶质瘤的发生有关。MGMT基因启动子甲基化调控了MGMT蛋白的表达,因此,检测MGMT基因甲基化状态有可能成为预测肿瘤对烷化剂化疗药物耐药性的分子标记。我们将脑胶质瘤患者随访资料对MGMT基因甲基化状态进行Kaplan-Merier生存曲线分析,结果显示MGMT甲基化的患者生存期要明显长于MGMT基因未甲基化的患者。本研究中的39例脑胶质瘤患者均进行了开颅手术切除、放疗和尼莫司汀化疗等综合治疗,但生存期的不同是否与MGMT甲基化状态调控了MGMT的表达,从而影响肿瘤对烷化剂敏感性有关呢?我们在另外的基础研究中,证实胶质瘤细胞株MGMT基因甲基化状态与MGMT蛋白表达和细胞株对烷化剂卡莫司汀和替莫唑胺的敏感性密切相关(另文发表),说明MGMT甲基化状态对脑胶质瘤患者生存期的影响是由于MG