玉米芯微波消解-内切木聚糖酶水解制备低聚木糖的工艺研究

玉米芯微波消解-内切木聚糖酶水解制备低聚木糖的工艺研究

低聚糖是由2.7个木糖分子-1和4个糖苷组组成的功能性聚糖。它比甘蔗和葡萄糖低40%，与葡萄糖相似，约为40%。低聚木糖对pH值及热的稳定性较好,即使是在酸性条件(pH=2.5)加热也基本不分解。低聚木糖极难被动物消化吸收,肠道内残存率高,具有极好的双歧杆菌增殖性,其选择利用性高于其他功能性低聚糖,为非消化功能性寡糖。低聚木糖是目前功能性寡糖中最能促进体内有益菌增长的活性糖。在猪、鸡生产中应用低聚木糖具有以下6个方面的作用:促进动物消化道内有益菌的繁殖,抑制有害菌生长,改善微生物菌群平衡;阻断病原菌与宿主细胞受体的结合;刺激动物机体的免疫系统,提高免疫力;增强动物抗病能力,减少发病率,提高对动物疾病的防治效果;改善饲料利用率,提高动物生产性能;降低对环境的污染,改善动物生产环境的卫生状况。随着人们对低聚木糖认识的深入,其作为一种新型绿色饲料添加剂受到广泛关注。玉米芯中木聚糖的含量可达到35%以上,是一种理想的制取低聚木糖的原料。压力自控密闭微波消解是将试样和溶剂放于耐压密闭容器里进行微波加热消解,自动控制密闭容器的压力,它结合了高压消解和微波加热迅速以及能使极性分子在高频交变电磁场中剧烈振动碰撞、摩擦、极化等方面的性能,可以削弱木聚糖与其他成分的结合力。我国最近就玉米芯中低聚木糖的提取也进行了一系列的研究,并取得了一定的成果。但目前我国对低聚木糖的研究主要用在食品添加剂上,不能满足饲料工业发展的要求。本文在已有文献报道的基础上,基于薄层层析和高效液相色谱检测技术,以低聚木糖得率为主要评价指标,研究碱法预处理的玉米芯微波消解-内切木聚糖酶水解制备低聚木糖的工艺条件,为低聚木糖在饲料中的应用奠定基础。1材料和方法1.1木二糖、燕麦木聚糖纯硅胶板:60F254(德国默克公司);内切木聚糖酶:夏盛生物技术有限公司;D-木糖,木二糖,木三糖标准品:日本WAKO公司产品;燕麦木聚糖:Sigma公司产品;乙腈:国药集团,色谱纯;微波消解仪:MDS-2003F,上海新仪微波化学科技有限公司;玉米芯:河南省民权县,已经粉碎成直径2mm及以下的颗粒,w(水分)=7.59%,w(灰分)=2.37%。1.2木聚糖酶活性的测定酶活性测定采用DNS法。一个单位的木聚糖酶酶活性定义为:在pH5.0以及50℃条件下,1min内水解木聚糖底物产生相当于1μmol木糖的还原糖的酶量,U。1.3洗后烘烤时间低聚木糖的制备采用碱法预处理玉米芯、微波消解后酶法降解工艺。碱法预处理条件为:称取玉米芯,加入10倍体积的1.0%NaOH溶液,60℃水浴浸泡过夜,然后用水充分洗至pH自然,60℃烘箱内烘至恒质量。微波消解的工艺条件为:取0.5g预处理的玉米芯粉至消解罐中,加10mL蒸馏水,加盖密封后放入消解炉中,微波处理压力和微波处理时间根据实验设计而变化。酶解工艺条件为:经微波处理后的样品加蒸馏水补充至10mL渣液,分别按比例往玉米芯渣液中加入内切木聚糖酶,在设定温度下酶解16h;取上清液测定还原糖和糠醛含量。1.4高效液相色谱法研究木寡糖和反应物酶解产物木寡糖的定性采用薄层层析法:玉米芯酶解液经煮沸灭酶、离心,取上清液点样至硅胶板上,于V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶1∶1的展层液中展层3～4h,于60℃下烘干2～3h,除尽溶剂后均匀的喷上一层苯胺-二苯胺-磷酸显色剂,于85℃下烘干10min显色。酶解产物木寡糖的高效液相色谱定量检测:仪器:Waters515型凝胶色谱仪;检测器:Waters2410示差折光检测器;层析柱:预填充柱RT300-7.8PolyspherCHPB(7.8×300mm,德国制造);流动相:纯水;流速:0.4mL·min-1;柱温:90℃;进样量:50μL。1.5低聚木糖对枯草芽孢杆菌活菌数的影响试验用枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌由本单位筛选、分离获得。枯草芽孢杆菌的活化和平板计数用Luria-Bertani(LB)培养基,乳酸杆菌的活化和平板计数用deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基。低聚木糖对枯草芽孢杆菌的增殖作用:分别向LB液体培养基中添加含量为0.1%～0.5%的低聚木糖,接种1%的活化种子液,30℃、200r·min-1培养20h后,以不加低聚木糖为对照,用平板计数法测定活菌数。低聚木糖对乳酸杆菌的增殖作用:37℃静止培养48h,用平板计数法测定活菌数。2结果与分析2.1微波消解前后木糖含量的变化微波处理时消解罐中的压力直接关系到微波消解仪反应罐中所能达到的温度,而温度是木聚糖游离速率的重要因素,微波消解时间和微波消解压力对木聚糖的降解又有很显著的交互作用,微波消解的强度需要严格控制,既要木聚糖充分的解离,还要保证木聚糖不会过度水解成木糖。糠醛是水解过程中木糖脱水生成的产物,是提取液中最主要的成色物质,也是衡量消解过程中副反应产生程度的指标,糠醛含量也可以反映微波消解过程中木糖的产生量;因此,以反应液中还原糖和糠醛含量作为综合反应指标,酶解加酶量为100U·g-1,酶解时间16h。由表1可以看出:微波消解压力在0.8MPa、微波作用15～45min时,提取液中检测不到还原糖,经木聚糖酶酶解后可以检测到还原糖,而且还原糖含量相差不大,薄层层析结果显示酶解前提取液中无低聚糖产生;当微波压力升至2.0MPa、微波作用仅3min时,提取液在酶解前就有大量还原糖产生,经薄层层析,有大量的木糖产生,而且糠醛质量浓度较高,达到0.675g·L-1,说明玉米芯中的木聚糖已过度水解。在微波消解仪作用下,低压长时间与高压短时间可以达到相同的实验结果。以酶解前后样品中还原糖含量之差为主要指标,糠醛含量为次要指标,选出5、7和13号酶解样品进行高效液相色谱分析,结果(表2)显示,7号样品低聚木糖质量浓度最高,达到(6.641±0.13)g·L-1,低聚木糖含量为81.43%,而5号样品低聚木糖含量最高,为82.31%,低聚木糖浓度为(6.309±0.11)g·L-1,13号样品木糖质量浓度最高,且显著高于5号和7号样品,达到(3.609±0.07)g·L-1,而且测定的还原糖质量浓度也为最高,达到(8.841±0.14)g·L-1,低聚木糖质量浓度仅为(5.441±0.14)g·L-1。按照微波消解规律,在2.0MPa下作用更短的时间(少于3min),也会降低木糖的质量浓度,但鉴于微波消解仪的压力上升需要一定的时间,综合酶解前后还原糖含量和糠醛含量指标,以及低聚木糖的质量浓度,选定微波消解压力1.6MPa,微波作用时间5min,此时微波作用后提取液中仅有少量还原糖(0.512g·L-1),酶解后还原糖含量达到6.309g·L-1,且糠醛含量较低(0.159g·L-1)。薄层层析显示,酶解液中的主要成分为木二糖,伴有少量的木糖、木三糖和其他低聚糖(图1)。2.2木聚糖最佳发酵温度木聚糖降解时,起主要作用的酶是β-D-1,4内切木聚糖酶和β-D-1,4外切木糖苷酶,β-D-1,4内切木聚糖酶的最适pH为4.0～5.0,木糖苷酶的最适pH为3.0～4.0,在pH4.0时木糖的得率最高,在pH7.0时木糖得率最低,而在pH5.0时低聚木糖得率较高,因此,一般制备低聚木糖的pH选在5.0～6.0较为适宜。Jeong等研究表明,利用枯草芽孢杆菌内切木聚糖酶制备木二糖时,在温度低于60℃时,木二糖产量最高;Yang等研究的玉米芯木聚糖生产木寡糖的最适温度为50℃。本文研究了pH4.0～7.0和温度40～60℃下木聚糖酶对玉米芯低聚木糖生产的影响。表3为实验设计表头。由表4可见,在不同pH和不同温度酶解条件下,酶解样品中低聚木糖含量从高到低依次是C3、A3、B4、C7和B3,而低聚木糖所占百分比从高到低依次是C3、B1、B7、B2、B3和A3,在实验的每个温度条件下,3号样品即pH5.0条件下无论是低聚木糖含量还是低聚木糖所占百分比都较其他pH条件下高,综合比较低聚木糖含量和低聚木糖所占百分比,C3样品中低聚木糖达到9.74g·L-1,低聚木糖所占百分比为88.0%,此时对应的酶解pH和酶解温度分别为pH5.0和60℃。由于60℃达到了本次试验温度设计的顶点,因此进一步试验了pH5.0、65℃时低聚木糖的生产,见表4最下列的D3。D3无论是低聚木糖质量浓度还是低聚木糖含量都低于C3,因此将C3作为低聚木糖生产的优化条件,即pH5.0和温度60℃。2.3酶解时间对低聚木糖的影响将经过微波消解压力1.6MPa、微波作用时间5min的玉米芯中加入适量的木聚糖酶提取液(加酶量以每g玉米芯中加入的木聚糖酶酶活力单位计),至60℃水浴酶解8h。结果(表5)显示,当加酶量为80U·g-1时,低聚木糖的质量浓度为(5.21±0.07)g·L-1,加酶量达到140U·g-1时,低聚木糖的浓度快速上升至(10.53±0.14)g·L-1,而随着加酶量的进一步增大,低聚木糖的浓度上升不明显,因此木聚糖酶量在140U·g-1时就可以满足低聚木糖的生产,此时酶解样品中低聚木糖含量为81.3%。表6考察了酶解时间对低聚木糖生产的影响。酶解时间为6h时,样品液中低聚木糖的浓度达到最高值11.02g·L-1。在酶解2h时,酶解液中低聚木糖含量为83.0%,浓度为7.21g·L-1,随着酶解时间的延长,低聚木糖的含量先是上升,4h后低聚木糖的含量开始下降,而木糖浓度和含量则随着酶解时间的延长而上升。说明水解刚开始时,由于木聚糖底物浓度高,内切木聚糖酶显示了较高的活力,随着酶解时间的延长低聚糖浓度不断升高,外切木聚糖酶活性得到激发,而内切木聚糖酶活性则受到抑制。2.4低聚木糖添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响将实验室获得的低聚木糖液体样品喷雾干燥,得到低聚木糖粉末,进行益生菌的体外增殖实验。结果(图2)表明:枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌在添加了一定量的低聚木糖后,菌落数都呈先上升后下降的趋势;枯草芽孢杆菌在低聚木糖添加量为0.4%时菌落数达到最高值2.48×108CFU·mL-1,不加低聚木糖时菌落数为1.35×108CFU·mL-1,增殖作用达到183%,之后增殖作用开始降低,当大量添加时反而抑制枯草芽孢杆菌的生长;乳酸杆菌在低聚木糖添加量为0.2%时菌落数达到最高值2.80×109CFU·mL-1,不加低聚木糖时菌落数为0.90×109CFU·mL-1,增殖作用达到311%。3低聚木糖的提取应用高效液相色谱分析,以低聚木糖的得率为主体评价指标,得到了玉米芯酶法制备低聚木糖的最佳工艺条件为微波处理压力1.6MPa,微波处理时间5min,木聚糖酶用量140U·g-1,酶解时间6h,玉米芯酶解液中的低聚木糖质量浓度可以达到11.02g·L-1。对益生菌的体外增殖实验表明,低聚木糖添加量在0.2%和0.4%时分别可以对乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌起到最好的增殖作用,添加量进一步提高反而会抑制这2种菌的生长。本次试验玉米芯中低聚木糖的提取,采用的是碱法预处理玉米芯微波消解后酶法降解工艺。其中评价低聚木糖生产的适宜条