酵母-葡聚糖和杆菌肽锌对早期断奶犊牛生长性能及胃肠道发育的影响

酵母-葡聚糖和杆菌肽锌对早期断奶犊牛生长性能及胃肠道发育的影响

胃不仅是动物消化和吸收食物的主要场所，也是身体的第一个防御屏障。定植于动物胃肠道中的良好的微生物菌群对肠道的组织形态、代谢和功能有极大的影响,有助于更大程度地发挥动物的生长性能。新生犊牛由于胃肠道消化机能及免疫屏障功能发育不健全,极易受病原微生物的侵害而引起腹泻,导致高发病率和高死亡率。饲用抗生素(antibiotics)通过非选择性抑菌或杀菌作用,可消除肠道有害微生物对犊牛生长的抑制作用。但是近年来,鉴于抗生素的大量使用导致了肠道菌群失衡等负效应,各国对抗生素的使用管理也越来越严格。因此,益生素(probiotics)的研究和应用逐步成为研究热点之一。研究表明,在5周龄内犊牛的代乳粉中添加抗生素和益生素对于降低犊牛腹泻和提高生长性能具有相似的效果。研究进一步证实,益生素可抑制由溶血性大肠杆菌导致的幼龄反刍动物腹泻,进而促进幼龄反刍动物的生长。酵母β-葡聚糖不同于植物细胞壁中的β-(1→4)葡聚糖,酵母β-葡聚糖主要来源于酵母细胞壁,是由D-葡聚糖通过β-(1→3)键的方式相结合,并含有高度分支的β-(1→6)键结合的多聚糖。它在消化道中不可溶,不吸收,同时不产生黏性。目前,关于酵母β-葡聚糖在幼龄反刍动物中应用的研究报道较少,特别是关于它对犊牛肠道微生物区系影响的报道就更为少见。本试验拟从早期断奶犊牛生长性能、肠道主要微生物数量及胃肠道组织发育3方面来比较酵母β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛肠道发育的影响,以期为早期断奶犊牛胃肠道发育调控提供理论依据。1材料和方法1.1杆菌肽锌的合成酵母β-葡聚糖为淡黄色粉末,购自珠海天添生物工程技术有限公司(批号20080701),干物质含量95.58%,粗蛋白质含量4.57%,纯度为82.75%。杆菌肽锌为淡褐色粉末,购自天津新星兽药厂,含量15%。大肠杆菌购自中国兽医药品监察所,菌株号cvcc222,血清型O141∶K99,是引起犊牛腹泻的主要治病菌。1.2试验内容和方案试验在中国农业科学院南口中试基地进行。选取20头新生健康荷斯坦公犊牛(购自三元奶牛场),按体重和出生时间一致原则随机分成4组,每组5个重复,每个重复1头牛。犊牛1~7日龄饲喂鲜乳,饲喂量为犊牛体重的8%。饲养试验于犊牛1周龄时进行,全期共28d。试验基础饲粮包括犊牛代乳粉和开食料2部分。整个试验期内每天分别于08:00和18:00饲喂犊牛代乳粉饲粮(用煮沸后冷却至40~45℃的热水与代乳粉干物质按7∶1的重量比冲泡),乳液饲喂量为犊牛体重的10%。于犊牛第21日龄起开始训练犊牛采食开食料饲粮,各组犊牛开食料的饲喂采用限饲制度,每头犊牛每天补饲300g,自由饮水,记录每天采食量。每头犊牛单独饲养于0.9m×3.5m的犊牛围栏,下铺设漏缝地板。试验用代乳粉为中国农业科学院饲料研究所家畜营养与饲料研究室研发的产品,开食料组成及营养水平与代乳粉营养水平见表1和表2。每千克开食料含Onekgofstarterdietcontains:Fe9mg,Cu12.5mg,Mn130mg,Zn100mg,Se0.3mg,I1.5mg,Co0.5mg,VA15000IU,VD35000IU,VE50mg。1.3验组的材料试验采用单因素试验设计,A组为对照组,B、C、D组为试验组,具体见表3。在试验第21天晨饲时,通过将大肠杆菌肉汤培养基(109个/mL)混入犊牛代乳品中对A、B、D3组进行口服大肠杆菌攻毒,攻毒剂量约为30mL。1.4样品采集、测量设计和方法1.4.1体重和耗料量在试验开始第1、14、21、28天晨饲前,称取每头犊牛的空腹体重。每日记录犊牛代乳粉和开食料的耗料量。统计各阶段犊牛的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和饲料转化率(F/G)。1.4.2肠道内容物的制备于试验第21天分别采集攻毒后3、12、24h犊牛直肠内约10cm处靠近上壶腹黏膜部的粪便样品,无菌操作,迅速带回实验室,放入带有玻璃珠的三角瓶中,称重后以1∶9(W/W)的比例加入无菌生理盐水,依次以10倍梯度稀释,选择适宜的稀释度,分别涂布在乳酸菌选择性培养基(MRS)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)(均购于北京陆桥技术有限责任公司),每个梯度做3组重复,于37℃恒温培养箱分别培养72、24h后计算菌落数,并以用1g肠道内容物中细菌个数的对数[lg(cfu/g)]表示直肠内容物中主要微生物数量。1.4.3组织切片及形态测量试验第28天晨饲前从各组随机选取3头犊牛,用4%戊巴比妥钠溶液(40mg/kgBW)将犊牛完全麻醉后,剖开腹腔分别在前背盲囊部分用利剪连续取下1cm2的组织块,另取十二指肠近端5cm处、空肠中段和回肠中段约1cm的肠管,用生理盐水冲洗残余内容物后,迅速将样品浸泡至入4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中固定,4℃固定48h后,石蜡包埋做组织切片。瘤胃及肠道固定样品经苏木精-伊红(HE)染色后,在10×10倍光镜(MoticBA200)下观测其形态结构的变化,并利用Moticimagesadvanced3.2软件测量瘤胃前背盲囊乳头高度、乳头宽度及黏膜厚度,小肠各部位绒毛高度、隐窝深度及黏膜厚度。每个样本观察2个非连续切片,每张切片选取3个视野,每个视野分别测定10组数据,其平均值作为1个测定数据。1.5平衡实验设计方差分析试验数据的统计与分析利用SAS8.2软件包中的平衡实验设计方差分析过程(ANOVA)进行,均值的多重比较采用Duncan氏法进行,以P<0.05作为差异显著性判断标准。结果以平均值±标准差来表示。2结果2.1对adg和f/g的影响由表4可见,大肠杆菌攻毒前,即第1~14天和第14~21天2个阶段时,与对照组相比,B组犊牛ADG分别提高了26.17%和24.93%(P<0.05),D组犊牛ADG分别提高了30.89%和28.57%(P<0.05);大肠杆菌攻毒后,即第22~28天期间,B、D组ADG分别比对照组提高了30.38%和30.81%(P<0.05),但与C组差异不显著(P>0.05)。对于试验各期F/G,B、D组均显著低于对照组,特别是大肠杆菌攻毒后,B、D组F/G比对照组分别降低了15.74%和20.81%(P<0.05),与C组差异不显著(P>0.05)。同样的,从试验全期来看,B、D组F/G比对照组分别降低了17.53%和19.58%(P<0.05)。2.2各组大鼠攻毒后乳酸官情况比较由表5可见,大肠杆菌攻毒后3、12和24h,B组犊牛直肠中乳酸杆菌数量高于对照组,但是差异不显著(P>0.05),D组3个时间点乳酸杆菌数量均显著低于B、C和对照组(P<0.05);而B、C组之间犊牛直肠乳酸杆菌数量无显著差异(P>0.05)。C组犊牛直肠中乳酸杆菌数量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,大肠杆菌攻毒后12h,B、D组显著降低了犊牛大肠杆菌攻毒后12和24h时直肠中大肠杆菌数量(P<0.05),分别降低了9.79%、10.09%与16.35%、15.38%。同时,B组在12和24h时犊牛直肠大肠杆菌数量显著高于C组(P<0.05)。同行数据肩标不同小写字母者差异显著(P<0.05),下表同。Inthesamerow,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05),thesameasbelow.2.3各组大鼠阴血压v/c组,c组与b组含量比较由表6可见,与对照组相比,B、C组可显著增加犊牛瘤胃乳头高度、宽度(P<0.05)。与对照组相比,各组犊牛十二指肠绒毛高度无显著差异(P>0.05),而C、D组犊牛十二指肠隐窝深度显著低于对照组和B组(P<0.05);B、C和D组绒毛高度和隐窝深度比(V/C)显著高于对照组(P<0.05)。各组犊牛空肠中段绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P>0.05),绒毛高度和隐窝深度比(V/C)也以试验B、C组显著高于对照组(P<0.05)。回肠中段各形态指标与空肠中段变化趋势相同,各组间绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P>0.05),但B、C和D组V/C显著高于对照组(P<0.05)。3讨论3.1-葡聚糖对幼龄动物生长性能的影响杆菌肽锌是多肽类抗生素,一方面它可以抑制肠内病原性微生物的增殖,促进有益微生物的生长,减少发病率,从而促进动物生长;另一方面,杆菌肽锌可使畜禽肠壁变薄,增加肠黏膜的通透性和改变肠内代谢环境,从而促进营养的消化吸收。研究表明,在火鸡饲粮中添加杆菌肽锌20、50和100mg/kg,饲料转化率分别提高了0.4%、1.1%和1.5%,增重分别提高了1.6%、2.3%和2.8%。据报道,在仔猪饲料中添加杆菌肽锌50mg/kg,增重比添加土霉素组提高了22.4%,饲料转化率提高了14.5%,并证明杆菌肽锌与硫酸抗敌素合用,可明显提高仔猪的增重、饲料报酬及具有良好的预防腹泻效果。目前,关于β-葡聚糖对幼龄动物生长性能的影响的报道较多,β-葡聚糖与其他免疫增强剂(如脂多糖)不同,它对动物的食欲、生长没有不良影响,并且在饲料中添加β-葡聚糖可以促进动物生长。在19日龄断奶仔猪的试验中发现,在饲料中添加0.05%~0.80%的β-葡聚糖可显著改善仔猪断奶第14天后的生长性能,所有β-葡聚糖添加组仔猪的饲料转化率均显著高于对照组(P<0.05)。而另一些研究认为β-葡聚糖提高仔猪的生长速度是由于提高了日采食量,对ADG和F/G无显著影响。本研究发现,大肠杆菌攻毒前,与对照组相比,酵母β-葡聚糖和杆菌肽锌均可显著提高犊牛ADG;同样,试验各期F/G,添加酵母β-葡聚糖(B组)和杆菌肽锌(D组)均显著低于对照组,而试验各期各组犊牛ADFI均无显著差异。就本试验来看,在正常的饲养模式下,酵母β-葡聚糖和杆菌肽锌对于提高犊牛生长性能具有相似的效果。本试验中大肠杆菌攻毒后,B、D组ADG显著高于对照组,但是与未攻毒组(C组)差异不显著。同样的,B、D组F/G显著低于对照组,但与未攻毒组差异不显著(P>0.05)。因此,在本试验攻毒应激模式下,酵母β-葡聚糖和杆菌肽锌可能会减轻大肠杆菌对犊牛的损伤,并且与未攻毒组差异不显著。对于酵母β-葡聚糖组来说,试验结果可能是由于在感染前使用β-葡聚糖可增强机体的免疫清除作用,将抗原抗体反应控制在膜免疫局部,减少了全身免疫的负担,并且这种免疫保护作用是以非炎症的方式来进行的,即对动物的生长没有不良影响。3.2酵母-葡聚糖和杆菌肽锌的制备对患者肠道增殖的影响研究证实,大肠杆菌、沙门氏菌和乳酸杆菌的生理功能与动物机体的生命活动息息相关。本试验在抑制直肠中大肠杆菌增殖上,酵母β-葡聚糖的抑菌效果略低于杆菌肽锌。这可能是由于酵母β-葡聚糖和杆菌肽锌在抑制大肠杆菌增殖上的方式不同,杆菌肽锌对革兰氏阳性细菌有强烈的抗菌作用,对部分革兰氏阴性菌、放线菌、螺旋菌体抑制效果也明显,其机制主要为抑制细菌的细菌壁合成,也能与敏感细菌的细胞膜结合,损伤细胞膜的完整性,导致细胞内重要物质外流,从而阻碍肠道内细菌繁殖。而β-葡聚糖主要是在结肠微生物的作用下生成短链脂肪酸,而短链脂肪酸能促进肠黏膜的生长。另一方面,β-葡聚糖可通过增加肠道分泌型免疫球蛋白(IgA)的分泌量而减少致病微生物对肠道的黏附,从而减少大肠杆菌增殖。3.3小鼠肠道功能特性与肠道感染的关系众所周知,瘤胃功能的建立是瘤胃内容物经发酵产生的挥发性脂肪酸刺激的结果。Lesmeister等通过统计学分析对试验所需犊牛数量、样品采集部位、样品采集数量等进行讨论,认为在评定瘤胃的指标中,瘤胃乳头的长度是最重要因素,其次是瘤胃乳头的宽度和黏膜厚度。本试验结果显示,瘤胃乳头长度、宽度和黏膜厚度随饲粮中酵母β-葡聚糖含量的增加而增大,其中酵母β-葡聚糖组显著高于其余各组,这与前述结果相一致,其原因可能是β-葡聚糖增加了总挥发性脂肪酸的产量,从而刺激瘤胃乳头发育有关。小肠的正常结构是营养物质被充分消化与吸收的基本保证。特别是小肠的绒毛长度、V/C、黏膜厚度及绒毛表面积是衡量小肠消化吸收功能的重要指标。肠绒毛高度与细胞数量呈显著相关。绒毛高,则成熟的上皮吸收细胞多,对肠道营养物质的吸收能力就强,隐窝深度反映了细胞生成率,隐窝基部向绒毛端部迁移、分化,形成具有吸收能力的绒毛细胞,以补充绒毛上皮的正常脱落,基部的细胞生成率降低,使隐窝变浅。V/C综合反映小肠的功能状况。比值上升,则黏膜改善,消化吸收功能增强;比值下降,消化吸收功能降低,动物生长发育受阻。陈代文等研究表明断奶仔猪饲粮由母乳转变为代乳品时如果饲养管理不善,极易加剧肠道对饲粮的过敏反应,仔猪小肠表现为严重绒毛脱落、肠黏膜细胞增生和隐窝细胞有丝分裂速度加快,进而导致了仔猪腹泻。而张运涛等研究表明酵母多糖对小肠黏膜的具有保护作用,扫描电镜观察表明,对照组小肠绒毛变形、微绒毛脱落,而