玉米多糖对sz诱导的糖尿病小鼠血糖、血脂、胰岛素及其外周细胞因子的影响

玉米多糖对sz诱导的糖尿病小鼠血糖、血脂、胰岛素及其外周细胞因子的影响

糖尿病是由体内胰岛素绝对或相对分泌不足引起的全身疾病。主要表现为喝得多、吃得多、尿、瘦、累、尿糖和血糖增加。中医属于“口渴”范畴。发病机制是内政伤阴入液，特点是“阴虚热”。治疗糖尿病以养阴生津为主。玉竹,又名葳蕤,《神农本草经》列为上品,为百合科植物玉竹的干燥根茎,性平、味甘,有滋阴润肺、生津养胃之功效,用于燥热、伤阴、津液耗伤的消渴之症。其多糖成分玉竹多糖(EA-PAOA)具有一定降血糖、降血脂、提高免疫力的功效,国内已有学者研究表明其能对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的血糖有明显的降低作用。STZ是目前使用最广泛的糖尿病动物模型化学诱导剂,对动物胰岛β细胞有特异性破坏作用,有学者认为,STZ首先损伤β细胞及有关细胞器的膜结构,导致酶扩散和酶活性改变,进而影响β细胞功能和结构的改变,也有学者针对STZ损伤胰岛β细胞分子水平作用机制研究认为,其毒性首先是将DNA碱基上的特殊位点烷基化再进一步作用于ADP核糖体合成酶,从而损伤胰岛β细胞。STZ本是一种广谱抗生素,有着抗菌抗肿瘤性能的同时,也有通过特异性损伤胰岛β细胞诱发糖尿病的副作用,利用STZ对胰岛β细胞有特异性损伤的特点,高剂量STZ致动物胰岛细胞坏死而无胰岛炎发生,诱导动物发生1型糖尿病,有方法简便、用药量少、特异性损伤胰岛β细胞、药物毒性较低的特点。本文通过建立STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型,探讨EA-PAOA对其降糖血脂作用机理。1中性多糖成分检测1.1药材与主要试剂:玉竹,原产地湖南,由广东康美药业股份有限公司提供,批号20080117。玉竹多糖(EA-PAOA)、链脲佐菌素(STZ)(上海Sigma公司,批号20080121),小鼠IL-4、IL-10和IFN-γ试剂盒(原装进口,美国BenderMedSystems公司,批号20071112),甘油三酯(TG)测定试剂盒(上海可欣生物技术研究所,批号20071122),胰岛素放免分析试剂盒(上海西唐科技公司,批号20080107)。1.2主要仪器:One-Touch血糖仪(德国Bayer公司),酶标仪(DG3022A型,上海)。1.3昆明小鼠,雌性,体质量(20±2)g,随机选取50只(由广东省华南农业大学实验动物中心提供,合格证号:粤动200710)。1.4方法1.4.1玉竹多糖的提取:药材采用热水提取,即药材洗净切碎后,以30%乙醇浸提,分离过滤。药材干燥后用10倍体积水加热沸腾提取3次,滤液合并,浓缩成生药的浓缩液。浓缩液以4体积的30%乙醇沉淀,离心分离醇沉部分,醇沉部分用水溶解,再次离心除去不溶物,浓缩。继续以4倍体积的30%乙醇沉淀,沉淀物加水水解,透析后冷冻干燥得黄棕色沉淀,即为中性多糖成分。1.4.2动物模型制备及分组:实验动物采用50只健康的雌性昆明小鼠(随机抽取)并分成五组,其中实验组分三个剂量组,采用玉竹多糖EA-PAOA的1g/kg为基础给药量,另取5倍、10倍量,即1g/kg(EA-PAOA1组)、5g/kg(EA-PAOA2组)、10g/kg(EA-PAOA3组)。并分正常对照组和糖尿病对照组,每组10只小鼠。正常对照组小鼠只注射等体积的枸橼酸钠缓冲液,其余小鼠应用0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液(PA4.4)配制成0.4%链脲佐菌素(STZ)溶液,按40mg/kg剂量进行腹腔注射,每天1次,连续5天,每周分别测血糖、尿糖、胰岛素及血脂,动态监测1型糖尿病模型建立。在注射STZ72小时后,血糖稳定升高,出现三多症状(多食、多饮、多尿)。最终以血糖≥11.1mmol/L,尿糖+++,甘油三酯≥3.00mmol/L以上2周,为造模成功,低于此值者弃去。正常对照组与糖尿病对照组,腹腔注射生理盐水0.5ml,每日1次,共4周;EA-PAOA1组(EA-PAOA1g/kg)、EA-PAOA2组(EA-PAOA5g/kg)、EA-PAOA3组(EA-PAOA10g/kg),分别以等体积的0.5ml进行腹腔注射,每日1次,共4周。空腹血糖测定:采用全血分析快速血糖测定法,取血后血糖仪检测。用药前及用药过程每周检测1次,共5次。末次灌胃后小鼠禁食5小时,然后以2%戊巴比妥钠麻醉,股动脉取全血分离血清用于测定胰岛素,切开腹腔迅速取出胰腺后置苦味酸-多聚甲醛固定液固定,乙醇洗涤、保存,备做病理;用铝箔包裹后置于液氮或-70℃保存,脾脏加入二甲基亚砜并用铝箔包裹后置于液氮。脾组织T细胞亚群测定:脾脏压磨、过滤、离心、振荡,重复离心,洗涤;加台盼蓝,显微镜下计数单核细胞;加Rat-anti-mouseCD4+和CD8+单抗,孵育、重复洗涤,加PBS制成单核细胞悬液;取1×106个细胞上流式细胞仪,进行T淋巴细胞亚群计数。胰岛病理学观察:胰腺石蜡包埋、切片,苏木素-伊红染色。由三位不同病理专业人员盲法读片,分别计数5只小鼠的胰岛数目,并进行胰岛炎分级计数。胰岛炎指数计算按每只鼠的胰腺组织在镜下随机计数5~10个胰岛,无胰岛炎为0;50%胰岛有炎症为0.5;100%为1。分级标准为,仅有胰岛周围淋巴细胞浸润,但未侵入胰岛内部为1级;浸润至胰岛内,但浸润程度低于50%为2级;浸润程度大于50%的为3级。细胞因子的检测:小鼠死前用摘眼球法取血,离心分离血清,分装成100μl置-20℃保存。采用酶联免疫分析法测定各组标本白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、细胞因子干扰素γ(IFN-γ)水平,操作方法按试剂盒说明进行,全部标本同批测定。1.4.3数据处理:以x¯±sx¯±s表示实验结果,P<0.01为差异有统计学意义。2各组小鼠血清所总胰岛素、il-4、il-10、il-1、fn-水平实验组空腹血糖水平、甘油三酯水平均比对照组有明显降低(P<0.01),胰岛素水平则有明显升高(P<0.01)血清淋巴细胞中,IL-4、IL-10,实验组较模型组高(P<0.01),IFN-γ,实验组较模型组低(P<0.01)。各项检测指标检测结果见表1~5。3型糖尿病的发病机制链脲佐菌素(STZ)是一种含亚硝基的化合物,能特异性破坏胰岛β细胞的DNA,大量的β细胞损伤和坏死导致胰岛素原合成障碍,从而引发糖尿病。本实验结果表1显示,玉竹多糖(EA-PAOA)注射组与模型对照组相比,各剂量组小鼠血糖明显降低,证实玉竹多糖具有明显的降血糖作用,而其中5g/kg组效果最为显著;10g/kg组与5g/kg组相比其降血糖作用无明显差异,但1g/kg组与5g/kg组相比降血糖作用不及5g/kg组。表明玉竹多糖的降糖作用无剂量依赖性,10g/kg组的降血糖作用并不优于5g/kg组。从本实验结果表3可见,玉竹多糖使小鼠血糖明显降低的同时,也使胰岛素水平明显升高,说明玉竹多糖对链脲佐菌素引起的胰岛β细胞破坏有一定的抑制作用,通过增强胰岛素敏感性而达到降糖作用。同时本组资料说明,玉竹多糖对链脲佐菌素引起的血脂水平紊乱有一定的改善作用,特别是甘油三酯水平有了明显降低,表明玉竹多糖对因血脂升高所造成的糖尿病的各种并发症可能具有一定的治疗作用,具有降糖作用以外的优势。细胞免疫在1型糖尿病发病机制中发挥着重要的作用,其特征表现为CD4+和CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞对胰岛的浸润引起的胰岛炎,选择性的胰岛β细胞损伤,导致胰岛素分泌下降或缺乏。T细胞在1型糖尿病的病理过程中起重要作用。我们的实验结果显示,在对照组小鼠的外周淋巴器官脾脏中以及胰岛组织浸润的炎症细胞中,均存在CD4+T细胞比例增多反应,及CD4+/CD8+T细胞比例增高,CD8+细胞数目的减少导致其细胞免疫功能低下;而在EA-PAOA预免疫的小鼠脾脏组织中的淋巴细胞则以CD8+T细胞亚群为主,CD4+/CD8+亚群比例下降,其胰腺组织中的CD4+T细胞浸润明显减少,且被限制在胰岛的外周。这说明EA-PAOA预防小鼠糖尿病发病的机制之一,是纠正其T细胞亚群的免疫失衡状态。正常机体中各T淋巴细胞亚群相互作用,对免疫系统进行上调和下调的功能,维持着机体的正常免疫功能。CD4+T淋巴细胞具有辅助和抑制的双重功能,根据其分泌细胞因子的不同,分为辅助性T细胞Th1和Th2亚群。Th1细胞通过分泌细胞因子干扰素γ(IFN-γ)抑制Th2细胞的功能,介导细胞免疫、细胞毒性T细胞和巨噬细胞活化以及迟发性超敏反应,生成过量的一氧化氮,对胰岛β细胞有直接的细胞毒性,加重胰岛炎程度,促进1型糖尿病的发生;反之,Th2细胞通过分泌白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)可下调抗原提呈细胞,抑制Th1细胞增生,对胰岛细胞起保护作用。有报道,1型糖尿病的发病机制包括辅助性T细胞(CD4+T淋巴细胞)活性增强和抑制性T细胞缺陷两个方面,造成免疫调节失控和细胞因子不平衡。我们的研究结果显示,模型组的IFN-γ水平明显升高,IL-4、IL-10水平明显降低;与模型组比较,EA-PAOA各组IFN-γ水平有不同程度的降低,IL-4、IL-10水平有不同程度的升高,接近甚至超过了正常水平。通过EA-PAOA各剂量组的对比观察,血糖、胰岛素、血清细胞因子含量5g/kg、10g/kg组均优于1g/kg,5g/kg组与10g/kg组比较血糖值无明显差异,但血清细胞因子供应量上却差别明显,10g/kg组效果更佳,表明随着药物剂量的增加,药效也随之增强