乳酸杆菌的分离筛选及其代谢产物协同抑菌作用的研究

乳酸杆菌的分离筛选及其代谢产物协同抑菌作用的研究

20世纪40年代以后，由于抗生素在畜牧业中的广泛应用和显著影响，人们对益生素的含义和应用没有给予充分关注。近年来,英国的疯牛病、比利时的二恶英事件和香港的瘦肉精中毒事件使消费者对动物产品的安全问题日渐关注,抗生素在饲料中添加可能引起的耐药性、残留和“三致”作用使益生素又重新得到了研究者和生产者的重视。益生素的再度兴起主要是由于人们对动物食品安全的要求提高。1908年IijaMetchnikoff发现保加利亚牧民长寿的原因是他们有食用酸奶的习惯,他认为酸奶中的乳酸杆菌能预防和治疗多种疾病。随后在20世纪前半叶,嗜酸乳酸杆菌广泛地应用于食品行业。自然界存在的乳酸杆菌至今未发现有致病作用的菌株,美国FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品种共43种,其中乳酸杆菌占12种,中华人民共和国农业部1999年公布允许使用的12种饲用微生物中有3种是乳酸杆菌。在美国,益生素工业上应用的产品57%含有乳酸杆菌属。何明清,等(1986)对病、健仔猪肠道菌群的研究发现,腹泻仔猪肠道中的乳酸杆菌数量显著下降,大肠杆菌数显著上升。使用乳酸杆菌益生素可以调整胃肠道微生态平衡,所以乳酸杆菌类益生素将是很有前途的防治仔猪腹泻的制剂。仔猪在生长早期容易患大肠杆菌性疾病,根据报道致病性大肠杆菌的主要血清型是K88、K99和987P,因此应用体外法测定乳酸杆菌抑制大肠杆菌的能力是评价乳酸杆菌益生作用的一项很有价值的指标。本试验通过测定乳酸杆菌的乳酸产量、采用平皿挖沟法测定其代谢产物对不同血清型大肠杆菌的抑制能力及用浓度梯度法测定乳酸杆菌菌体和代谢产物对大肠杆菌的协同抑制作用。1材料和方法1.1ph、n、n-fmo乳酸杆菌培养基:MRS肉汤培养基(蛋白胨,10g;牛肉浸膏,10g;酵母浸粉,5g;磷酸氢二钾,2g;枸椽酸二铵,2g;葡萄糖,20g;七水硫酸镁,0.58g;蒸馏水,1000ml;用1mol/LNaOH调pH到7.0)。3种血清型的大肠杆菌(K88、K99和987P)均购自中国兽药监察所。乳酸杆菌:3株分离自21日龄断奶后健康仔猪的胃粘膜上皮。大肠杆菌培养基:营养肉汤(购自上海市医学化验所试剂厂)。检测大肠杆菌的培养基;麦康凯(MacConkay)培养基(购自北京天坛生物制品股份有限公司)。大肠杆菌在麦康凯琼脂上长成红色菌落。1.2菌种距离检测乳酸杆菌培养液:每个亨盖氏(Hungates)管里加MRS肉汤约15ml,然后充二氧化碳,用0.1%新配的刃天青溶液作氧指示剂,无氧时刃天青呈无色。加盖后在高压蒸汽灭菌锅里经121℃保持15分钟,制成无菌厌氧MRS肉汤。待凉下来后接种从健康仔猪胃里分离的3株乳酸杆菌,接种量为1%(约107CFU/ml),在37℃培养箱里培养24小时后,置4℃冰箱保存备用。乳酸的测定:取2ml乳酸杆菌培养液,15000r/min离心15分钟,取上清液,用超纯水稀释后在TehniconRH100生化分析仪上测定。抑制大肠杆菌试验:A:制作麦康凯培养基,无菌操作倾倒平皿,每个平皿的培养基厚度约为6mm。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域,每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液(4.0×108CFU/ml)于培养基表面,然后在距平皿中线约4cm的地方挖一宽为1cm的沟,与划线的培养物垂直,如图1所示。分别用3株不同的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出),置普通培养箱37℃培养18小时后,观察测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。B:根据A试验的结果,选择其中一株乳酸杆菌,取5ml该乳酸杆菌培养物(8.2×109CFU/ml)分别与5、10、15ml营养肉汤混合,制成3个含不同乳酸杆菌培养物浓度的营养肉汤,接种大肠杆菌,接种量为培养液的5%,置37℃,5%CO2培养箱培养4、8和18个小时后,分别用无菌注射器取出培养液,培养液经梯度稀释成10-2~10-5后,每个稀释度作4个平行样,取0.3ml稀释液,用接种棒均匀涂布于麦康凯琼脂平板上,置37℃,普通培养箱培养18个小时,取菌落数在50~150个的平皿计数,取平均值,计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。2结果与讨论2.1表1显示了24小时后对乳酸杆菌菌进行栽培的牛奶量乳酸是乳酸杆菌的代谢产物之一,据报道乳酸是乳酸杆菌代谢产物中对大肠杆菌起抑制作用的主要成分。2.2离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离平皿挖沟法抑菌试验的原理与平皿挖孔法相似,是由于放置于沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来达到对大肠杆菌的抑制作用,随着离沟距离的增大,能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。所以乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标,距离越大,说明其代谢产物所含抗菌物质的抑菌效果越好,结果见表2。从表2可以看出,本试验所用3株乳酸杆菌的代谢产物对大肠杆菌K88和K99都有很强的抑制作用,而对987P的抑制作用较弱,乳酸杆菌3甚至对987P没有抑制作用。结果表明,乳酸杆菌的代谢产物对不同血清型大肠杆菌的抑制作用有一定的差别。结合表1和2的结果可以认为,乳酸产量相近的乳酸杆菌对同一血清型大肠杆菌的抑制作用存在差异,可以推断,乳酸杆菌的代谢产物中对大肠杆菌起抑制作用的成分不止乳酸一种,但乳酸可降低培养基pH值,这可能会增强乳酸杆菌分泌的其它成分如细菌素、过氧化氢等对大肠杆菌的抑制作用。2.3乳酸杆菌对不同血清型大肠杆菌的抑制作用从表3可以看出,乳酸杆菌培养物占肉汤50%时,经过4小时培养后,大肠杆菌数量下降了40~60倍,再经过4小时的培养,大肠杆菌的数量下降得更快,K88下降近4000倍,K99下降近2000倍,987P下降近100倍,共培养18个小时之后,在培养液里已检测不出大肠杆菌,说明大肠杆菌已全部被杀死。不同血清型的大肠杆菌在含1/2乳酸杆菌培养物的营养肉汤中数量下降速度不同,说明在含50%乳酸杆菌培养液的肉汤中,乳酸杆菌对不同血清型大肠杆菌具有不同的抑制作用。乳酸杆菌培养物含量为1/3和1/4的肉汤中,经过4小时培养后,大肠杆菌数量分别下降了25倍和15倍左右,再经过4小时的培养,大肠杆菌的数量下降得更快,三种大肠杆菌都下降近1000倍,共培养18个小时之后,在培养液里已没有大肠杆菌,说明大肠杆菌已全部被杀死。不同血清型的大肠杆菌在同样浓度的乳酸杆菌培养物中数量下降速度基本相同,说明在含1/3和1/4乳酸杆菌培养液的营养肉汤中,乳酸杆菌对不同血清型大肠杆菌的抑制作用基本相同,抑菌作用比含50%的乳酸杆菌培养液的营养肉汤时较弱,但18小时之后的抑菌效果是一样的。随着培养时间的延长,大肠杆菌数量下降的速度加快,可能是在培养初期乳酸杆菌的主要作用是抑制大肠杆菌,而在后期则主要是杀菌作用。随着培养时间的延长,乳酸杆菌的生长及其代谢产物的积累提高了其杀