栽培番茄mi-1基因研究进展

栽培番茄mi-1基因研究进展

根结线虫（meloidold.）是一种严重的疾病，主要发生在热带和温带地区。其寄主范围非常广泛,超过5500种作物,其中包括单子叶植物、双子叶植物、草本植物和木本植物。植物被根结线虫侵染后,在根系产生巨细胞和根结,根结线虫从中汲取养分,完成生活史。植物感染根结线虫易导致减产,植株萎蔫,并很容易被其他土传性病害侵染。通过农业操作、物理防治、化学防治、生物防治等手段虽然可以在一定程度上缓解根结线虫对作物造成的危害,但是不能从根本上解决根结线虫的危害,甚至会对环境造成破坏,而选育抗病品种是一种经济、有效、环保的防治途径。番茄(Solanumlycopersicum)作为一种重要的蔬菜作物,也是根结线虫的重要寄主之一,但是通过选育具有抗病基因的番茄材料,可以在很大程度上缓解根结线虫对番茄造成的危害。目前已知的番茄中根结线虫病抗性基因共有9个,分别为Mi-1、Mi-2……Mi-9,对这些抗病基因进行研究,可以加快抗病新品种的选育。1抗根结线昆虫疾病基因mi-11.1mi-1基因对番茄抗根结线虫病的抗性番茄对根结线虫病的抗性最早是在秘鲁番茄(S.peruvianum)PI128657中发现的,该番茄种与栽培番茄很难杂交。20世纪40年代,Smith通过胚挽救的方法,实现了PI128657与栽培番茄的杂交,唯一的一株杂交F1单株成为了目前鲜食番茄和加工番茄抗根结线虫病材料的来源。通过遗传分析,确定PI128657中的根结线虫病抗性基因为单基因显性遗传控制,将其命名为Mi基因,也就是现在所说的Mi-1基因。该基因除了具有对根结线虫病的抗性以外,对马铃薯长管蚜虫(Macrosiphumeuphorbiae)和白粉虱(Bemisiatabaci)造成的病害均具有抗性。此外,番茄白粉病的抗病基因很可能也是Mi-1基因,或者是该基因的同源基因。通过分子标记筛选,获得了与抗病基因连锁的分子标记,将Mi-1基因定位到了番茄6号染色体的短臂端。在同工酶标记Aps-1和DNA标记Rex-1等的帮助下,Mi-1基因被用于很多的栽培番茄材料中。在含有Mi-1基因的番茄材料中,根结线虫不能使植物产生巨型细胞,而是在线虫所侵染的区域发生过敏性反应,抑制线虫取食。1.2mi-1基因序列的扩增Mi-1基因的克隆是通过图位克隆的方法实现的。Mi-1基因的精细定位是一个艰苦的过程,因为在Mi-1基因的位点处会发生重组抑制现象,很难找到距Mi-1基因较近的连锁的分子标记。近年来,Mi-1基因所处的区域内的重组抑制现象的原因得到了进一步研究。通过对抗感病栽培番茄材料该区域的BAC文库分析,确定在这个区域内,抗感病材料间存在染色体区段的倒置现象。之后对这一区段进行荧光原位杂交的分析,同样发现染色体区段的倒置,这就很好地解释了Mi-1基因位点处重组抑制的现象。之后通过含有21089株F2单株的群体,将Mi-1定位在550kb间隔的区域内。为了进一步克服重组抑制的影响,利用秘鲁番茄材料PI128657和LA2964构建了假F2群体(pseudo-F2population,因为两亲本所构建的F1单株自交不亲和,所以将不同的F1单株进行杂交,获得的后代群体与F2群体的分离比例相同,但是因为并非是由F1单株自交所获得的F2群体,因此将这一群体称为假F2群体),将Mi-1定位在标记C32.1与C93.1之间,对比这两个标记在栽培番茄VFNT中的信息,将Mi-1基因确定在65kb间隔的区域内。对该区域内的BAC进行序列分析,获得了2个候选基因Mi-1.1和Mi-1.2,它们具有95%的序列同源性,通过转基因互补性试验,确定Mi-1.2为根结线虫病的抗性基因,即Mi-1基因。该基因编码1257个氨基酸,具有亮氨酸拉链、核苷酸结合位点和富亮氨酸重复区域,是具有这些结构的抗病基因家族的一员。1.3mi-1在不同发育时期的生长很多抗病基因都是组成型基因,在植物中无所不在。利用Mi-1基因的特异引物对抗根结线虫的番茄材料在不同时期、不同器官中Mi-1基因的表达状况进行了RT-PCR分析。结果显示,在抗病材料Motelle的种子、根系、茎、叶、花和果实中均可以检测到Mi-1基因的表达,而在感病材料Moneymaker所有器官中均检测不到Mi-1基因的表达。Mi-1基因的表达在叶片和根系不同发育时期,以及接种前后都不会发生明显的变化。在抗根结线虫病的番茄发芽后24h接种根结线虫,发现其具有抗病性。而Mi-1基因对蚜虫的抗性受到发育的调控,植株发芽5周以后,才具有对蚜虫的抗性,对白粉虱的抗病性同样受到了发育的调控。同一个基因,在表达状况相似时,表现出对不同病原物的抗性,可能与其转录后的调控有关,这方面的研究还在进行中。1.4mi-1基因对根结线虫的抗性Mi-1基因是栽培番茄中唯一存在的根结线虫病的抗性基因,也是番茄中所有9个已知抗病基因中唯一被克隆的基因。在过去60多年中,该基因在抗根结线虫病中,发挥了巨大作用。但其应用也受到了日益严重的挑战,主要来自两个方面:一方面,具有Mi-1基因的番茄材料在土壤温度高于28℃时就丧失了对根结线虫病的抗性,这在夏季炎热地区和保护地栽培中是非常不利的;另一方面,单一抗原对根结线虫的选择,使得根结线虫进化,产生了可以突破Mi-1基因抗性的线虫群体,对本来具有抗性的番茄材料产生致病性。因为这两方面的挑战,选育具有优良抗病基因的栽培番茄,就显得十分重要了。2mi-9基因的抗性为了弥补Mi-1基因在生产中的不足,需要对其他存在于野生番茄中的根结线虫病抗性基因加以研究和利用。在这些基因中,有一些基因具有热稳定的根结线虫抗性,在土壤温度达到32℃时仍然保持良好的抗病性;有一些基因具有对突破Mi-1抗性的线虫群体具有抗病性。对这些基因的研究将会是番茄根结线虫病抗性育种的一个重要策略。目前研究较多的基因主要是Mi-3基因和Mi-9基因。材料PI126443-1MH(S.peruvianum)中的Mi-3基因对根结线虫557R(Mi-1基因对它无抗性)具有抗性,并且在土壤温度达到32℃时仍然保持对根结线虫的抗性,该基因被定位在番茄第12号染色体的短臂端,位于标记P22L与E21L之间的0.25cM间隔区域内,标记N22R与Mi-3基因共分离,可以用于标记辅助选择育种。材料LA2157(S.arcanum)中具有对根结线虫病的单显性抗性基因Mi-9,与Mi-1有很多的相似点。两个基因均对南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)具有抗性;这2个基因均定位于番茄6号染色体短臂端的同一区域内;标记REX-1和C8B在定位这两个基因的群体内均具有连锁遗传关系。但是Mi-9基因在土壤温度达到32℃时仍然具有热稳定的根结线虫病抗性。通过病毒诱导的基因沉默技术,利用Mi-1基因序列成功地将LA2157中Mi-9的抗性沉默,证实Mi-9基因与Mi-1基因具有同源性。相对于Mi-3和Mi-9基因,其他野生番茄中根结线虫病的抗性基因研究相对较少,大多只是进行了抗谱鉴定和遗传分析(表1)。3mi-1基因检测在Mi-1基因克隆后,位于基因内的PCR标记被开发,彻底避免了在标记辅助选择中因为标记和基因分离所造成的误选。Mi-1基因除了为栽培番茄提供根结线虫的抗性外,还可以赋予那些受根结线虫危害严重,而又不具有抗原基因的作物以抗性。Mi-1基因通过农杆菌侵染,转化到莴苣中,在转基因植株中检测到了Mi-1基因的表达,转基因莴苣对根结线虫病的抗性得以提升。Mi-1基因从野生番茄导入栽培番茄是通过胚挽救的方法实现的,利用这种方法,同样可以尝试将其他根结线虫病抗性基因导入到栽培番茄中。如将含有Mi-3基因的野生番茄材料与栽培番茄杂交,通过分子检测的手段,证实获得了杂交F1植株,但尚缺乏应用方面的报道。4mi-1与根结线虫抗性抗病基因在抵御病原物方面发挥了巨大作用,而植物的抗病性是一个复杂的反应。植物免疫需要识别病原物入侵的检测系统。植株在发挥其抗病性时,其中的一些作用因子可以与抗病蛋白质发生互作,是抗病功能所需要的。通过突变体的诱导和筛选,获得了根结线虫病和蚜虫病抗性丧失的突变体Rme1,并确定该突变体只对这两种病害失去抗性。对该突变体进一步研究证实,Mi-1基因在对根结线虫、蚜虫和白粉虱发挥抗性时需要Rme1基因。此外对携带Mi-1基因并转化有水杨酸羟化酶基因NahG的植株进行研究,发现水杨酸是诱导植株产生根结线虫抗性的一个重要的信号原件。病毒诱导的基因沉默技术是通过构建病毒载体,将目的基因沉默,可以用来研究某一基因或该基因家族的功能。利用该技术不仅在研究番茄根结线虫病抗性基因间的关系时发挥了很大作用,在研究与抗病基因Mi-1相关的基因功能时,同样发挥了重要作用。分裂素活化蛋白激酶级联反应与Mi-1基因对蚜虫的抗性有关系。对热激蛋白Hsp90-1基因和与其互作的Sgt1-1基因进行基因沉默都可以使植株对根结线虫和蚜虫的抗性能力下降。WRKY72转录因子与Mi-1诱导的根结线虫抗性有关,又因为WRKY72的作用基因对水杨酸没有响应,因此认为WRKY72转录因子所发挥的抗性,是通过独立于水杨酸防御机制的另一种途径实现的。SlSERK1的沉默证明其在蚜虫的抗性方面发挥着作用,但是在对根结线虫的抗性方面没有影响。这些相关基因的不断研究,可以用来解释Mi-1基因对蚜虫和根结线虫发挥抗性的机理。5抗根结线虫基因的研究随着生物技术的发展、生物信息学的进步和新的抗病材料的发现,番茄中根结线虫病抗性基因在育种中的应用前景是广阔的。野生番茄中优良的抗根结线虫基因的定位,可以用于标记辅助育种,加快优良基因向栽培番茄的选育。抗病基因的克隆,可以为尚未克隆相关基因的其他作物提供研究基础,加快抗病基因的