先天性甲状腺功能减退症患者shr基因突变与家系遗传分析

先天性甲状腺功能减退症患者shr基因突变与家系遗传分析

天津医科大学新生儿验证室自1982年开展新生儿先天性甲状腺功能减退（a级）。在评估儿童时，他们立即补充了甲状腺激素，并根据医疗建议接受治疗。长期疗效满意。先天性甲减发病与某些基因的突变有关,然而大部分病例的发病机制尚不清楚。TSH受体(TSHR)等位基因的失活性突变,表现为甲状腺对TSH完全或部分不敏感,TSH-TSHR-cAMP级联反应功能障碍,导致甲状腺发育不良和(或)激素合成障碍。TSHR基因突变引起先天性甲减的家系报道越来越多,大部分突变位于TSHR基因第10号外显子编码区,其次是第1、4、6号外显子。TSHR突变位点不同,临床表现不尽一致,突变基因型与临床表型存在异质性。为了探讨天津市区先天性甲减TSHR基因突变情况及遗传规律,本研究采用PCR-SSCP及DNA测序方法研究18例先天性甲减患者TSHR第1、4、6、10号外显子基因突变情况。对象和方法一、病例选择选择结果天津医科大学新生儿筛查室检出并经实验室检测确诊的先天性甲减患者18例(男11,女7),年龄(11.9±7.4)岁(2个月～22岁)。除一个家系兄妹同患此病外,均为散发。所有患者经B超、99mTc扫描检查,甲状腺缺如10例,异位1例,发育不良4例,甲状腺肿大3例。TSH受体抗体(TRAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)及甲状腺球蛋白抗体(TGAb)均为阴性,无其他先天性畸形,父母及其他家庭成员无临床甲减表现。随机选择健康体检者35名为正常对照组(男18,女17),年龄(26.1±10.6)岁(6～44岁)。无甲状腺疾病家族史,甲状腺激素检测无异常、自身抗体TRAb、TPOAb及TGAb均阴性。二、方法1.提取dns用TKM法提取外周血白细胞基因组DNA。2.增加tshpa,2.2扩增全序列参考有关文献合成引物,PCR分别扩增TSHR基因第1、4、6、10号外显子,记做TSHR-exon1(302bp,60℃)、TSHR-exon4(329bp,58℃)、TSHR-exon6(293bp,52℃),第10号外显子分5段扩增全序列,分别为TSHR-A(357bp,58℃)、TSHR-B(376bp,58℃)、TSHR-C(356bp,60℃)TSHR-D(323bp,58℃)、TSHR-E(310bp,60℃)。引物由北京奥科生物公司合成。3.循环次数:以5s,32s,3230s,94℃预变性2min,94℃30s,58℃～60℃30s,72℃30s,共循环30次,循环完成后72℃延伸5min。用含溴化乙锭的2%琼脂糖电泳观察PCR产物扩增情况,如在相应分子量位置扩增带清晰,可进行下一步的SSCP分析。4.电泳总pcr检测应用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶4℃～8℃150V,电泳14～16h后硝酸银染色。每次电泳都以正常对照组作为参照,若同时电泳的患者PCR产物出现条带增多、减少或条带泳动增快、减慢即说明存在变异。每份标本均做2次SSCP。5.dna序列分析对电泳出现异常条带的患者PCR产物测序,采用BeckmanCoulter公司CEQ8000型DNA序列分析仪进行正反双向测定。测序引物同PCR引物,计算机软件自动处理数据,以波形和碱基序列输出测序结果。结果一、sscp的观察TSHR基因第1、4、6、10号外显子PCR产物,用含溴化乙锭的2%琼脂糖电泳观察,条带清晰可用于SSCP。全部先天性甲减患者TSHR第1、4、6、10号外显子PCR-SSCP分析后,在同1例先天性甲减患儿发现TSHR-BSSCP电泳条带明显减慢,TSHR-ESSCP电泳条带明显增快,重复2次结果均相同(图1)。二、tshr突变1.脏器正常运行及组织学检查对1例先天性甲减患儿TSHR-B、E正反向测序发现2处点突变,均为纯合子型:1349G→A,密码子由CGC转换为CAC,450位氨基酸置换即Arg450→His;2181C→G,密码子由GAC转换为GAG,727位氨基酸置换即Asp727→Glu(图2、3)。先证者男性,出生后用时间分辨荧光免疫分析滤纸干血TSH及T4纸片RIA试剂盒筛查,结果分别为TSH46.7mIU/L,T415.48nmol/L,甲状腺B超示双侧甲状腺形态发育欠佳,甲状腺ECT检查示显像稀疏,核素摄取低下,甲状腺发育不良,TGAb、TPOAb均阴性。诊断为先天性甲减,甲状腺发育不良。即开始服甲状腺片10mg/d,逐渐调整剂量。2～3月龄父母曾自行停药,发现皮肤粗糙后就诊,口服左旋甲状腺素(L-T4)片至今,智力骨骼发育正常。2.复合杂合子遗传图谱对10名家系成员TSHR-B、E正反向测序,筛查出R450H/D727E复合杂合子6人:Ⅰ2、Ⅰ4、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ7、Ⅱ8,以女性携带为主,隐性遗传规律,绘制系谱图(图4～6)。家系成员10人血清甲状腺激素均正常,杂合子中5人血清sTSH轻微增高(表1)。tsh基因突变TSH与TSHR结合后与G蛋白的α亚单位(Gsα)偶联并激活cAMP信号系统发挥作用,从而调控甲状腺细胞分化、分泌功能。依赖TSH的cAMP级联反应系统的功能过强或过弱都将影响甲状腺细胞增殖与功能。TSHR基因失活性突变导致先天性甲减,为常染色体隐性遗传,多数家系表现为2个位点复合杂合子,亦有1个位点纯合子。第10号外显子编码TSHR肽链穿膜区,失活性突变与基因多态性大部分位于第10号外显子。TSHR基因450位密码子由CGC转换为CAC,结果450位氨基酸置换即Arg450→His(R450H),R450H型突变位于TSHR第2穿膜段,首先由Nagashima等报道,筛查TSH抵抗的1对兄弟的TSHR基因,2人突变位点一样,均为R450H和G498S双位点杂合子型突变,血清TSH增高,甲状腺激素正常,甲状腺解剖位置正常,仅有轻度发育不良。其父母为1个位点突变杂合子,均不发病,TSH未增高。将R450H和G498S型突变基因分别转染COS-7细胞,携带R450H型基因细胞对TSH反应降低,cAMP水平轻度下降,而转染G498S型基因细胞对TSH反应明显降低,cAMP水平低于前者。流式细胞仪分析二者在细胞膜表达均较野生型低,转染G498S型基因的细胞更为显著。本研究发现的TSHR基因突变型、临床表现均与Nagashima等报道不同,该患儿复合纯合子R450H/D727E,血清甲状腺激素降低,诊断为先天性甲减。R450H纯合子型突变导致该患儿发病,这表明R450H纯合子比杂合子对甲状腺发育与功能影响更显著。R450H纯合子失活性突变导致TSHR肽链一级结构及功能结构域改变,TSH与TSHR结合后与Gsα偶联障碍,不能正常激活cAMP信号系统,TSH对甲状腺上皮细胞的功能调节作用缺陷,依赖TSH的cAMP调节级联反应系统的功能减弱,从而影响甲状腺细胞增殖及功能,结果表现为甲状腺发育差,功能减退。该患儿为甲状腺发育不良的永久性甲状腺功能减退症,适合甲状腺激素终生替代治疗。另有研究证明,甲状腺功能正常高TSH血症并且非自身免疫性亚临床甲减可能存在TSHR基因突变。Alberti等研究10例非自身免疫性亚临床甲减,sTSH轻到中度升高,4例存在TSHR基因突变;deRoux等研究1家族中3例甲状腺功能正常的高TSH血症患者,发现TSHR基因为混合性杂合子突变Ile167Asp/Pro162Ala。本研究与这些报道有相似之处。本组Ⅰ2、Ⅰ4、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ7、Ⅱ8共计6人同时存在R450H/D727E复合杂合子型点突变,以女性携带为主,为隐性遗传。6例杂合子中除Ⅱ7外5例sTSH轻微升高,这种复合杂合子可能存在一定程度TSH抵抗,但甲状腺功能仍然保持正常,并无临床甲减表现。亚临床甲减诊断主要依据血清TSH值,其正常范围尚需统一。国内报道测定2247名正常人TSH,确定TSHICMA法正常值:3.0～4mIU/L,在诊断亚临床甲减采用血清TSH>4.8mIU/L标准。对亚临床甲减的筛查与治疗颇有争议,若血清TSH>10mIU/L且TPOAb阳性或高胆固醇血症可以给予L-T4治疗。Surks等总结1995～2002年195篇关于亚临床甲减的文献,认为亚临床甲减与临床甲减肯定关联,血清TSH>10mIU/L与高胆固醇血症肯定关联,但给予甲状腺激素干预后的效果证据不足。本研究中5例R450H/D727E杂合子的sTSH轻微升高,这种已经明确基因突变的亚临床甲减病例不多见,对于6.0mIU/L<sTSH<10mIU/L的杂合子,临床工作中如何提高诊治水平是个具有挑战性课题。D727E位于TSHR胞内C端,目前认为它是TSHR基因的多态性,D727E在功能自主性甲状腺病中有一定分布频率,