不同侵染时间南方根结线虫病的诊断

不同侵染时间南方根结线虫病的诊断

以南方根结线虫、爪哇根结线虫、水生根结线虫和北方根结线虫为主要植物病原体的根结线虫，危害多个作物的根系，带来重大疾病，包括瓜、茄子和豆类。关于线虫问题,多数研究集中在防治方面,近些年在抗性基因定位、克隆、品种分子选育等方面也有研究报道,但对根结线虫侵染后根部组织结构变化的研究较少,仅见少量有关巨型细胞的报道。如,爪哇根结线虫(M.javanica)侵染豆科植物(Viciafaba)后正常细胞核多次分裂而胞质不分裂,从而形成巨型细胞;巨型细胞过多消耗寄主营养,影响植物体营养和水分的运输;根结线虫侵染鹰嘴豆(chickpea)后所产生的巨型细胞来源取决于取食位点细胞,位点不同,细胞来源可能不同,由此推断巨型细胞可以来源于多种细胞;不同种的根结线虫,侵染产生的巨型细胞数量不同,每个巨型细胞内的细胞核数目不同,取食位点也不同;植物对根结线虫的抗性表现在植物生长过程中对巨型细胞的解体形式,如南方根结线虫侵染不同品种的烟草,产生的巨型细胞在不同品种中的解体形式不同,抗性品种中所产生的巨型细胞以空洞化的形式解体,以此枯竭根结线虫的食物来源,最终导致根结线虫饥饿死亡,由此认为巨型细胞空洞化具有积极意义,可能是寄主植物的一种抗性机制。但是,此时的巨型细胞毕竟已经导致了植物过多营养的消耗以及营养和水分的运输。因此,跟踪观察根结线虫侵入寄主植物后不同时间内巨型细胞的形成部位和来源分化、维管组织的病理学特征,对及时采取有效措施控制根结危害部位的扩展、进而控制生产中根结线虫的危害有指导意义。本研究拟观察南方根结线虫侵染黄瓜(Cucumissativus)寄主后,随侵染时间的延长,根部根结的病理结构变化,以明确根部受害时间、部位及病理特征,为进一步探讨根结线虫的致病机理、确定防治时间、选择或研制有效的防治药剂提供参考。1材料和方法1.1幼虫的采集和接种自来水洗带有大量根结的寄主根系,去表面土后,1%(质量分数)的NaClO消毒4min,自来水冲洗3min,蒸馏水漂洗4次,剖取根上的卵块置于30μm尼龙筛上,室温孵化二龄幼虫,每日收集幼虫,4℃保存,取近5d内收集的幼虫接种。1.2微生物和线虫花卉营养土(吉林省德惠市芳洁花土厂生产)、沙子和黏土按3∶3∶0.5比例(体积比)混合,高压灭菌锅121℃、0.105MP大气压下湿热灭菌40mim,以杀死其中的微生物和线虫。将灭菌土装入具有小格(上底4.5cm×4.5cm、下底3cm×3cm、高5cm)的培养盘内,装2盘,每盘72棵。黄瓜种子(市售千秋四号)浸泡发芽后,分别埋入方格中,每格种子1粒。28℃、14h和20℃、10h光照培养箱培养,每2d淋或浇1次水。长出第1片真叶时(约6d)在其中一盘内每孔接种根结线虫约150条,作为处理,未接种根结线虫的一盘作为对照。接种后每2d取样观察1次,记录黄瓜根系根结数量、大小,并进行染色、切片观察。1.3红法染色观察分别取接种苗及对照苗6株,次氯酸钠-酸性品红法染色观察,酸性甘油(加若干滴5mol/LHCl)保存,于OlympusBX51光学显微镜下观察根结的形成及其部位,并拍照。1.4faa染色及转染南方根结线虫在19.5℃下生活周期为44d,30℃条件下生活周期20d。本试验黄瓜幼苗培养温度为20～28℃,观察至第30天根表面见到卵块止(根结线虫1个生活周期)。从接种后第3天开始,每2d取接种及对照幼苗各3株切片染色。第1次取初发现的根结,之后每次取根系上较大的根结,对照苗取根系对应部位。FAA固定24h后每隔1h依次用体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%的酒精脱水,其中100%酒精脱2次;二甲苯透明后60℃浸蜡包埋;旋转切片机横、纵切片,厚度10μm;动物胶粘片于载玻片上,40℃烘干,番红-固绿对染,加拿大树胶封固,OlympusBX51光学显微镜下观察并拍照。2结果与分析2.1苗木生长正常,苗木直径经济,黄瓜幼苗接种根结线虫后,在观察周期内,根结数量及根结最大直径变化随接种天数的增加而增加(图1)。接种后6d,在接种苗的各级侧根根尖部位开始见有根结(图2(c)),直径最大可达0.5mm,而对照根相应部位只有0.1mm;接种后10d,对照根系生长正常,主根明显,下胚轴笔直,苗根的相应部位只有0.2mm(图2(a)),而接种苗主根不明显,下胚轴弯曲。根尖部位及远离根尖的部位均有明显根结(rk),既有对称的又有偏于一侧的,部分根结成串存在(图2(b)),直径最大可达1.1mm;16d时接种苗根结数量明显增多,直至第30天时平均每株幼苗根结数增加到54.5个,根结直径最大可达2.8mm(图1),而对照根无根结,相应部位只有0.4mm。2.2龄根结线虫的分离和鉴定本实验观察到根结出现的第一时间在接种后第6d,根尖部位整体透明NaClO-酸性品红染色后,观察到红色膨大、对称的根结,最初出现部位主要在各级侧根尖端的分生区及伸长区(图2(c));接种后8d,通过NaClO-酸性品红染色,在伸长区之上的根毛区及更上方可见侵入根内的二龄根结线虫(图2(f));接种后10d,根系整体观察,根结线虫侵染的幼苗主根不明显,下胚轴弯曲,根结明显,有的连接成串,可见既有对称又有偏于一侧的根结(图2(b))。2.3差生木质部prx导管的转分化分别取接种后6d(第一时间出现根结)至30d(根结中出现卵块)的接种苗根结部位与对照苗根的相应部位做石蜡横、纵切片观察。接种根结线虫6d时的黄瓜幼苗根尖纵切显示根结在分生区、伸长区形成,二龄幼虫已经侵入根中,建立了取食位点并形成了巨型细胞(gc)(图2(d)),在相应部位的根结横切面上,可见根中央出现的具有多核、细胞质浓厚的5个巨型细胞,周围没有维管组织分化(图2(e))。随着侵染时间的延长至第8天时,根结可成串存在,且巨型细胞的数目也随之增多。随着根的伸长生长及组织的分化,10d时根结横切面可见在巨型细胞占据的后生木质部周围有3束(三原型)原生木质部(prx)导管(图2(g)),此时对照横切显示的是三原型初生木质部(px)导管和与木质部相间排列的初生韧皮部(pp)(图2(i))。由此分析认为,根结内的巨型细胞可能是由原形成层细胞中本应分化为后生木质部导管的细胞转分化形成,巨型细胞所在的相应部位应该是后生木质部的位置。接种后10d的根结纵切显示,根中央的巨型细胞隔断了后生木质部上下相通的导管(ve)(图2(h)),而对照纵切面图2(j)中可看到根中央的木质部导管(ve)上下贯通。接种后12d时,有的根结在已经形成了初生维管组织的部位产生,横切可见巨型细胞(gc)位于初生木质部的外侧(图2(k)),说明巨型细胞是由维管组织外围的薄壁细胞分化形成。接种后16d,根结横切面显示,无论在根中央(图2(l))或偏于一侧(图2(m))的巨型细胞均已有次生木质部(sx)导管形成,而同期对照根中仍为初生维管组织,说明巨型细胞导致寄主根提早分化产生次生维管组织。接种后20d,对照横切图2(n)显示,三原型的初生木质部(px)之间仅有少量次生木质部(sx)导管形成,维管组织排列有序,而同时期的根结内已存在有大量次生木质部的导管,根的中柱过度膨大,皮层相对变薄,根的横切面直径明显增大,巨型细胞数量增多、体积增大,更多的维管组织外围细胞大量分化,形成新的维管组织(nvt)(图2(o))。说明巨型细胞数量的增加刺激维管组织外围细胞大量分化,在皮层中形成新的维管组织。接种后24d,图2(p)根结纵切显示导管分子排列完全扭曲,维管组织上下迂回连通。接种后30d,根结横切显示(图2(q))有些巨型细胞内营养被根结线虫吸收,细胞出现空洞(vagc),维管组织虽然多,但排列处于混乱无序状态。3讨论3.1根结线虫感染的病理特征及主要症状的分析3.1.1型细胞的形成已有研究结果表明,根结线虫侵染寄主形成根结的过程主要是通过二龄幼虫从根系近根冠部位侵入,穿过生长锥向伸长区移动,寻找适宜的侵入位点细胞,同时食道腺分泌物质,刺激线虫头部围绕的寄主细胞形成5～7个巨型细胞,由此形成根结。本研究病理组织切片表明,根结线虫的侵入不仅导致巨型细胞产生、随之出现根结图2(c),图2(e),还使次生维管组织提早形成图2(l),图2(m),使皮层中逐渐出现新的维管组织图2(o),因此,寄主被侵染16d以后较膨大的根结(直径1.3～1.5mm)是由巨型细胞、次生维管组织、皮层中新维管组织共同形成。3.1.2根结线虫核心细胞的染正本研究发现根结有与根系中心对称图2(b)、图2(l)和偏于寄主根系一侧图2(b)、图2(m)2种类型。本研究认为其与根结线虫侵染位置和巨型细胞来源有关:当根结线虫侵染根尖分生区、伸长区部位时,巨型细胞在伸长区来源于原形成层细胞,伸长区细胞发育至成熟区时,则巨型细胞来源于本应分化为后生木质部导管的细胞,此种情况下的巨型细胞出现在寄主根系中央,根结与根系中心对称;当根结线虫侵染寄主根系的成熟区或以上部位时,巨型细胞由维管柱外侧韧皮薄壁细胞、中柱鞘及皮层细胞分化而来,出现在根的维管柱一侧,根结偏于根系中心一侧。3.1.3型钢细胞空洞化的作用机制本研究发现接种后30d时,可见巨型细胞中营养被侵入的根结线虫耗尽,细胞出现空洞图2(m),图2(q),表现出细胞衰老,被侵染植株根系已经异常,地上部分生长也已经受到影响乃至枯萎死亡。有研究认为巨型细胞空洞化是寄主植物的一种抗性机制,因为作为根结线虫唯一生活来源的巨型细胞一旦空洞,根结线虫因将失去养料来源而死亡。本研究认为,巨型细胞空洞化对寄主植物是否有积极意义主要决定于空洞化出现的时间。如果在根结线虫侵入的早期时间约10d以前,幼虫尚未发育为成虫,细胞空洞后,线虫死亡,根系次生维管组织产生,弥补巨型细胞阻断的后生木质部形成、薄壁细胞分化和阻隔的导管上下贯通,植株可以继续发育,巨型细胞空洞化对寄主植物具有积极意义。如果根结线虫侵入时间过长(约30d以后),线虫已经发育为孕卵的成虫,并已经开始产卵,此时空洞的巨型细胞虽然最终能使其死亡,但线虫的卵已经产出,寄主根系已经由上百条根结线虫在几十个根结内、造成了上千个巨型细胞空洞(每条线虫造成5～7个巨型细胞),即使寄主是抗性品种,能否耐受如此损伤有待观察。3.1.4立地条件对分布的影响传统的植物病理学认为,根结线虫的致病机理是通过吸收巨型细胞中的营养而消耗寄主营养,导致寄主受害,严重时枯萎死亡。本研究的病理组织切片表明,根结线虫侵染寄主16d后,巨型细胞、提早形成的次生维管组织图2(l),图2(m)、皮层中的新维管组织图2(o)共同消耗寄主植物营养,直至枯竭,从而影响植株的正常生长发育,乃至枯萎死亡。除此之外,本研究认为多种细胞分化而来的巨型细胞不仅影响根中多种细胞组织的正常分化和组织器官的形成图2(g),图2(k);而且还隔断正常维管组织的排列,迫使导管迂回连接或在皮层中形成图2(h),图2(p),从而严重影响寄主根系的正常吸收与运输。3.2根结线虫的免疫根结线虫接触到寄主植物并侵入到根内需要12～24h,之后可在1～2d内形成根结,本研究第一时间发现根结的时间是在接种后6d,说明根结线虫在根际土壤环境中需要1～2天的时间接触到寄主。有研究表明,尽管抗性品种,根结线虫的侵入也会使寄主根系出现膨大的根结,组织结构出现巨型细胞,且不同抗性品种根内的巨型细胞数量及形成并无明显差异,即植物对根结线虫的抗性并不