分子生物学研究法 (下)

分子生物学研究法(下)

第六章

分子生物学研究方法(下)本章主要内容基因表达研究技术蛋白质组学及研究技术1基因改造技术（1）体外改造1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal31酶切→连接酶。2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚合反应，连接反应。定点突变（site-directedmutagenesis）是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状，是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。基因的体外改造（2）体内改造基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因失活。1）同源重组2）非同源重组

2.1凝胶阻滞试验（gelretardationassay）凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay,EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。

当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。2DNA与蛋白质相互作用研究

凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合

2.2DNaseI足迹试验（DNAfoot-printingassay）将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生一次磷酸二酯键断裂。

若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的空白区域，人们形象地称之为“足迹”。32p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)(b)DNaseI足迹实验3酵母双杂交系统(yeast-twohybridsystem)酵母双杂交体系也叫interactiontrap（相互作用陷井），是上世纪90年代初期发展起来的一种敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，也是体内鉴定基因的方法。可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一种蛋白质及其编码基因，而且还可以用来确定蛋白质相互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。

酵母双杂交体系在细胞周期调节、信号传导、肿瘤基因表达等诸多的研究领域，都有着广泛的应用。a.DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，它可识别效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并与之结合。b.转录激活域(Transcriptionalactivationdomain,AD)，它通过与转录机器(transcriptionmachinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下游基因进行转录。转录因子的两个主要结构域酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。

在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNA-BD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4DNA-BD和GAL4AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用，所以不能激活其相关的效应基因进行转录。若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Baitprotein)

1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因)。酵母双杂交体系的构建过程把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上。2）第二种质粒载体pGAD424，又叫做文库质粒载体或AD质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表达文库的专用载体。形成第二种杂种蛋白质(Y)。这种与AD融合的蛋白质叫做基因文库编码蛋白质，其中可与诱饵蛋白质发生相互作用的特称为猎物蛋白质(preyprotein)把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。（2）酵母双杂交体系的寄主菌株

将酿酒酵母基因组中的GAL4的编码基因剔除掉，发展成酵母双杂交体系转化系统的寄主菌株。例如SFY526和HF7c等。SFY526菌株：HF7c菌株：(a)丧失了表达内源GAL4转录因子的能力。(b)具有lacZ报告基因。(c)trp1和leu2转化标记，在无Trp和Leu的培养基中不生长。(a)丧失了表达内源GAL4转录因子的能力。(b)具有His3和LacZ报告基因。(c)trp1和leu2转化标记，在无Trp和Leu的培养基中不生长。（3）共转化从大肠杆菌细胞中分别提取杂种质粒I和杂种质粒Ⅱ，并共转化酵母菌株(例如)HF7c。涂布在选择培养基(缺少His、Leu和Trp三种氨基酸)上，以便筛选那些表达相互作用的杂种蛋白质的菌落。1）如果已知蛋白质同一种由文库编码的蛋白质发生了相互作用，则构成了一种有功能的GAL4转录因子。2）这种有功能活性的GAL4转录因子能识别GAL4效应基因上游的激活序列(GAL4UAS)，从而启动下游报告基因(lacZ或his3)的表达。3）若报告基因是lacZ,则可通过显色反应筛选阳性克隆。酵母双杂交基本原理示意图AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因ADYGAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因转录XDNABDADYXDNABD(a)(b)(c)总结：酵母双杂交系统是一项研究蛋白质之间相互作用的实验技术。其系统组成及原理如下：GAL4蛋白是酵母的转录激活因子，具有DNA结合结构域（DNAbindingdomain，BD；位于氨基端1～147氨基酸）和转录激活结构域（transcriptionalactivatingdomain，AD；位于羧基端768～881氨基酸）。为了研究已知蛋白X与未知蛋白Y之间是否能够相互作用，则将GAL4的BD编码区cDNA与蛋白X的cDNA按正确的ORF阅读框连接在一起，构建一重组质粒；同理，将GAL4的AD的cDNA与蛋白Y的cDNA连接在一起，构建另一重组质粒。将两种质粒共转化工程酵母菌（其编码GAL4的基因已缺损），则二者分别表达融合蛋白“BD-X”（“诱饵”，bait）和“AD-Y”）（“猎物”或靶蛋白，preyortargetprotein)。若蛋白X和Y二者之间在酵母细胞核内能够发生相互作用，则相当于将原来已拆开的BD和AD又连在了一起，GAL4的活性被恢复，识别并结合于特异的DNA调控元件上，进而激活其下游报告基因（如lacZ）的表达。若X与Y不发生相互作用，则报告基因不表达。即，通过检测报告基因是否表达，就可分析蛋白X与Y二者之间是否发生了相互作用。生物芯片的概念及其种类和作用生物芯片（biochip）是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、蛋白质及其它生物组分的快速、敏感、高效的处理。生物芯片可以分为DNA芯片、蛋白质芯片和其它芯片三类。其中前两者属于检测芯片。（1）DNA芯片可以通过杂交来检测样品中的核酸，也可以利用双链DNA与蛋白质的相互作用来检测蛋白质。（2）蛋白质芯片利用蛋白质间的相互作用如抗原-抗体反应或受体-配体之间的特异作用来进行检测。（3）其它生物芯片有样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片等，即在芯片上分别进行样品的分离、扩增、生化反应等过程。4基因芯片DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（insitusynthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又称为基因芯片（genechips）、DNA微阵列（DNAmicroarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidearray）等。基因芯片检测原理和步骤举例(1)制作芯片：将核苷酸序列探针，固定于芯片上，芯片上可固定成千上万个探针。（2）从被测对象的细胞中提取DNA，用酶切成较小的片段，并对DNA作荧光标记，并熔解成单链。（3）将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交，凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上，不能互补的片段会被洗脱掉。（4）对芯片上的荧光作扫描和分析。DNA微阵列技术示意图微阵列杂交图

5RNAi(RNAinterference)技术（1）相关概念

RNAi(RNAinterference，RNAi):是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象。当向细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi具有特异性和高效性。此现象发生在转录后水平，又称为转录后基因表达沉默。RNAi是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。siRNA（smallinterferingRNAs）是一种由Dicer酶切dsRNA而来的短片断双链RNA分子(21-23bp)，参与RAN干扰过程。

Dicer：是一种RNaseIII,能特异识别和逐步切割外源双链RNA，将RNA降解为21-23bp的双链RNAs(siRNAs)。

RISC（RNA-inducedsilencingcomplex,诱导沉默复合物）：由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。(2)作用机制长片断双链RNADicer酶ATPADP+PisiRNA(21-25bp)蛋白复合物形成阶段siRNP双链RNA解链阶段ATPADP+PiRISC识别并降解目标RNA激活RISC需要一个依赖ATP的将siRNA解离为单链的过程。活化的RISC在单链siRNA引导下通过碱基配对识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下，在距离siRNA3ˊ端12个碱基的位置切割mRNA。最后靶mRNA可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。6噬菌体展示技术噬菌体展示（phagedisplay）技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，再通过亲和富集法筛选表达外源蛋白的噬菌体。其建立基于三个原因：

(1)形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持有外源蛋白的活性。(2)利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体。通过多轮“吸附-洗脱-扩增”过程，即噬菌体与靶分子结合而被保留，未吸附的噬菌体则被洗去，吸附的噬菌体可以从表面再回收，再感染细菌，从而大量富集噬菌体。(3)外源多肽或蛋白质表达于噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分，可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序被推导出来。从噬菌体抗体库中筛选特异性抗体经典方法主要有两种：1)将纯抗原包被在固相介质上，如酶标板或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。2)将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉抗生物素蛋白的磁珠上对噬菌体进行筛选。

反义RNA技术反义RNA是指与靶RNA(多为mRNA)互补的RNA分子。根据反义RNA的作用机制,可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。反义RNA技术示意图7研究基因差异表达的主要技术差别杂交（筛选）（differentialhybridization）扣除（消减）杂交（subtractivehybridizationofcDNA，SHD）mRNA差异显示（mRNAdifferentialdisplay，DD）抑制消减杂交法（suppressionsubtractivehybridization,SSH）代表性差异分析（representialdisplayanalysis，RDA）交互扣除RNA差别显示（reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay）基因表达系列（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）分析电子消减（electronicsubtraction）DNA微列阵分析（DNAmicroarray）

根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keepinggene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动;而把在生物个体发育的不同阶段，或是在不同组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的基因称为差别表达（differentialexpression）基因。1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee发明了一种叫