连续培养大肠杆菌dh5及其突变株da19对葡萄糖的吸收和平衡

连续培养大肠杆菌dh5及其突变株da19对葡萄糖的吸收和平衡

对大肠杆菌代谢工程的影响dh5是常见的山羊细菌，但其基本培养基中的生长不好，含有大量醋酸。其乙酸耐受突变株DA19的生长和乙酸积累都得到明显改善,研究二者代谢差异对大肠杆菌的代谢工程有指导意义。DH5α在碳源限制的基本培养基中连续培养时非常容易被生长得率提高的突变株取代,而在氮源限制下即使发生这样的突变,也不会显示生长优势被富集,而且碳源的过量更有利于研究乙酸生产的特点。本研究在氮源限制的基本培养基中进行了大肠杆菌DH5α及DA19的连续培养,比较了它们代谢流分布的差异,并结合酶活测定的结果,分析了造成二者代谢差异的原因。1材料和方法1.1hsdr17reca1nda15大肠杆菌DH5α[supE44ΔlacU169(80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1]。DA19是DH5α的耐乙酸突变株,由本实验室筛选。1.2含na2hpo412h2oLB培养基(1L)含蛋白胨(英国Oxiod公司)10g,酵母抽提物(Oxiod公司)5g,NaCl10g,pH7.2。M培养基(1L)含Na2HPO4·12H2O15.12g,KH2PO43g,NaCl0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,CaCl20.011g,葡萄糖2g,氯化铵1g,10g·L-1维生素B10.2ml,微量元素混合液0.2ml,pH7.0。MN培养基为氮源限制的M培养基,1L中含葡萄糖8g,氯化铵0.3g,其他成分与M培养基相同。MNA培养基为添加了3g·L-1乙酸钠的MN培养基。所有培养基都采用去离子水配制。1.3连续培养和培养过程将1ml冷冻保存的菌种接入250ml锥形瓶里的30mlLB培养基中,旋转摇床30℃,250r·min-1培养12h为一级种子。转接3ml一级种子于装有100mlM培养基的500ml锥形瓶中,相同条件DA19培养10h,DH5α培养17h,为二级种子。连续培养在5L发酵罐(RIBE-5,华东理工大学)中进行,利用国家生化工程技术研究中心(上海)的TopHawk软件由计算机控制和采集在线数据。发酵罐装2.5LMN或MNA培养基,接入二级种子200ml,在搅拌转速500r·min-1,通气量4L·min-1,温度30℃下分批培养至静止期,用2台蠕动泵分别以相同速率加入新鲜培养基和抽出培养液,使连续培养的总体积恒定(约2.1L)。培养过程DO不低于30%。每隔4h取样测定菌体浓度、葡萄糖浓度和pH,连续3次不变即认为到达稳态。1.4细胞破碎后各酶的检测菌体浓度采用浊度法,将培养液适当稀释后测OD600,按标准曲线计算菌体干重。葡萄糖浓度采用葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定。铵离子浓度采用Berthelot法比色测定。乙酸和丙酮酸浓度采用离子色谱(美国Dionex公司ICS1500离子色谱仪,IonpacAS11-HC4×250mm阴离子分析柱和IonpacAG11-HC4×50mm保护柱,电导检测器检测)。乙醇浓度采用气相色谱方法测定(GC112A,Chromosorib101填充柱)。对细胞破碎后的6-磷酸葡萄糖脱氢酶、磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、乙酸激酶和异柠檬酸裂解酶进行测定。每一种酶的酶活为3次测定的平均值。1.5生物前体及代谢流分布的计算大肠杆菌代谢网络主要包括糖酵解(EMP)、三羧酸循环(TCA)、磷酸戊糖(PP)途径、补给途径和乙酸途径,见图1。大肠杆菌通过磷酸转移酶系统(PTS)摄取葡萄糖,每摄取1mol葡萄糖消耗1molPEP并生成1mol丙酮酸。PP途径不仅为生物大分子合成提供前体,而且还为生物合成提供还原力——NADPH,当菌体产生的NADPH过量时,通过反应22把NADPH转换为NADH,经呼吸链氧化。因异柠檬酸裂解酶受到葡萄糖的阻遏,过量葡萄糖存在下不考虑该途径。用于形成菌体的前体需求根据大肠杆菌的菌体组成计算。本研究采用物料平衡法计算代谢流分布。根据各节点代谢物的流量平衡,有Ax(t)=r(t)(1)式中A为m×n的化学计量系数矩阵,x(t)为n维流量向量,r(t)为m维代谢物浓度变化率/摄取率/生产率向量。本研究分析连续培养稳态下的流量分布,中间代谢物浓度恒定,与胞外交换的代谢物流量可测得,因此流量分布的计算为由式(1)得到的线性方程组的解。根据图1,对中间代谢物建立了包括22个未知流量的22个方程,具有唯一解。2结果与讨论2.1菌株代谢和活性DH5α和DA19连续培养的稳态结果见表1。在各实验中,连续培养的稳态铵离子浓度均为0,反映了铵的限制。在MN中,DA19关于葡萄糖的得率系数(YX/S)比DH5α提高了24%,而葡萄糖比消耗速率(QS)、乙酸和丙酮酸比生成速率(QAC、QPyr)都有所降低。添加乙酸钠后,菌体倾向于避免自身乙酸的形成,因此二者在MNA培养基中的乙酸比生成速率比在MN培养基中低,而YX/S下降,QS和QPyr增加,但DH5α的QPyr增加了67%,而DA19仅增加24%。这都表明DA19提高了葡萄糖的利用效率,代谢效率明显提高。除了乙酸外,两个菌株在MN和MNA中连续培养时都有丙酮酸的分泌,这是由于在氮源限制的连续培养过程中菌体过量吸收的葡萄糖所致。DH5α的QPyr高于DA19,这与DH5α的QS更高有关。除此之外,DH5α在MN的连续培养中还检测到了乙醇(在MNA中未检测到乙醇),这在好氧培养过程中是很少见的。双向电泳显示,在此培养条件下DH5α中由yahK编码的依赖于锌离子与NAD(P)的醇脱氢酶的蛋白量是DA19的7倍左右,在添加乙酸钠的情况下为3.15倍。该酶具有与adh基因产物类似的功能,即参与NADH的周转,同时产生醇类物质。Berrios-Rivera等认为,即使在有氧条件下,过量的NADH也会激活本来无活性的途径,使得菌体倾向于形成多消耗NADH的产物,如乙醇。由此推测DH5α胞内NADH的水平较高,有限的呼吸链容量无法有效地将NADH氧化成NAD+,从而造成了乙醇的产生。DH5α通过产乙酸途径来为菌体提供能量,表明其TCA循环或呼吸链通量限制,再加上其有乙醇分泌,表明其氧化磷酸化的限制。DA19在相同的条件下则没有检测到乙醇的存在,且QAC低,反映了DA19的氧化磷酸化能力高于DH5α。在碳源限制的基本培养基中进行连续培养时,只有当比生长速率超过产乙酸临界比生长速率时,才会有乙酸产生。张晓云对M培养基(碳源限制)中分批培养的动力学分析显示,DA19产乙酸的临界比生长速率为0.23h-1,而在MN培养基的连续培养过程中,在比生长速率0.13h-1时就已经有乙酸的分泌,这是因为在MN培养基中的QS(3.33mmol·g-1·h-1)比碳源限制分批培养对数期时的QS(1.33mmol·g-1·h-1)要大得多,因此过量的碳源以乙酸的形式被分泌到胞外。2.2mna和mn培养基中的副产物流动网络DA19和DH5α在氮源限制的连续培养中,稳态代谢流分布见表2。DH5α的酵解途径(EMP)流量高于相同情况下DA19的EMP流量,但两者的r2对r1的分流比接近,都在93%左右。两个菌株PP途径的流量很小,且十分接近。这是因为TCA循环产生的NADPH可以满足菌体合成的需求,使得PP途径的功能主要是提供合成菌体前体物质,而二者比生长速率基本相同的缘故。DH5α中TCA循环的流量(r8)则低于相同情况下DA19的流量,反映了DA19氧化磷酸化能力的改善。DH5α具有较高的EMP流量和较低的TCA循环流量,造成乙酸和丙酮酸等副产物的更大流量。在MN和MNA培养基中两个菌株代谢网络中的丙酮酸和乙酰辅酶A节点流量有较明显差异,见图2。DA19在MN培养基中分泌丙酮酸的分流比比DH5α低29%左右,而在MNA培养基中则要低48%。同时,DA19在MN培养基中乙酸的分流比比DH5α低22%,而TCA分流比则要高出22%左右。在MNA培养基中,DA19的乙酸的分流比比DH5α低34%,而TCA则要高出20%。在MN培养基中,DA19的TCA的绝对流量比DH5α提高了将近12%,而在MNA培养基中提高了将近51%。这说明DA19的TCA流量限制小,较有效地将丙酮酸流向TCA循环,减少乙酸的分泌。这些优势在添加乙酸的培养基中更加显著。根据代谢流分布结果,可以计算ATP(取P/O比为2)和二氧化碳的比生成速率QATP、QCO2,以及比耗氧速率QO2,在此基础上可以计算呼吸熵RQ、菌体的ATP得率YATP和碳回收率,其结果见表3。两个菌株的碳回收率都非常接近100%。ATP的产生速率远远大于菌体合成所需的ATP,两个菌株的YATP很低,仅2～3g·mol-1,远低于能量偶合时的10g·mol-1左右。双向电泳显示DA19的由atpA编码的ATP合成酶F1部分α亚基的表达水平显著高于DH5α,达30倍。由此推测:由于ATP合成酶的限制,DH5α电子传递所产生的能量不能有效转化到ATP中,而是以热量的形式浪费掉。DH5α在MN中的连续培养还产生了乙醇,这反映了DH5α不能将代谢所产生的NADH完全通过氧化磷酸化途径周转,因此实际QATP很可能远低于表3的计算结果。2.3磷酸戊糖对da19的tca循环能力的影响DA19和DH5α在相近比生长速率下代谢流分布明显不同,因此对连续培养过程中的关键酶活进行了测定,考察其酶活的变化是否与代谢流分析的结果一致。酶活测定结果见图3。磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是EMP和PP途径的限速酶。DA19的磷酸果糖激酶(PFK)酶活仅为DH5α的22%(MN和MNA),与其代谢流r2低的结果一致。DA19的G6PDH活性远远高于DH5α,为3.8倍(MN和MNA),但代谢流(r11)没有明显差异。这是由于在同样的比生长速率下二者合成细胞所需前体相同,而磷酸戊糖途径主要起提供前体的作用,NADPH可由TCA循环提供。异柠檬酸脱氢酶(ICDH)是TCA循环中的一个酶,DA19的ICDH为DH5α的1.18倍(MN中)和1.43倍(MNA中),这与代谢流分析的结果一致,反映DA19的TCA循环能力要高于DH5α。DH5α的ICDH活性在添加乙酸钠后降低了29%,只有DA19的70%;而DA19的ICDH在添加乙酸钠后则只降低了14%,表明外源乙酸对DH5α的TCA循环流量影响要大于DA19。乙酸激酶(ACK)是产乙酸途径中一个关键酶。在MN培养基中,DA19的ACK酶活为DH5α的60%,乙酸流量相应比DH5α降低了约29%。在MNA培养基中,DA19的ACK酶活为DH5α的74%,也与二者的乙酸流量变化趋势一致。异柠檬酸裂解酶(ICL)是涉及乙酸代谢的一个重要酶,但因葡萄糖对ICL表达存在阻遏作用,测得的ICL活性很低,与Peng等以乙酸为碳源时的0.12μmol·min-1·(mgprotein)-1相比可以忽略不计,这与构建网络时的假设一致。综上所述,除了6-磷酸葡萄糖脱氢酶以外,酶活与代谢流的差异一致。3发酵过程中的脂肪酸生成与出发菌株DH5α相比,乙酸耐受突变株DA19在MN和MNA的连续培养过程中的葡萄糖比消耗速率降低,乙酸和丙酮酸比生成速率都有所降低,而菌体关于葡萄糖的得率YX/S提高,其代谢效率要高于DH5α。代谢流和酶活分析结果都表明:DH5α和DA19在EMP和TCA循环途径存在显著差异。DA19的TCA循环/电子传递链的能力提高,从而减少了乙酸等副产物的分泌。这些优势在添加乙酸钠的MNA培养基中体现得更加明显。对于DH5α,推测其胞内氧化磷酸化通量较低,从而造成胞内NADH浓度增高,限制了TCA循环。大肠杆菌生长快,营养要求简单,遗传背景