阿霉素抑制mcf-7adm细胞耐药模型的建立

阿霉素抑制mcf-7adm细胞耐药模型的建立

0mdr的产生机制乳腺癌是女性常见的肿瘤之一，严重威胁女性的身心健康。据统计,世界范围内每年新增患者约200万人,死亡率呈逐年上升趋势［１－２］。目前,乳腺癌的治疗中,化疗占有十分重要的地位,尤其是对于癌细胞已经扩散的患者,化疗是主要的治疗方法。然而随着化疗药物使用时间的增长,化疗药物对肿瘤细胞的杀死作用逐渐减小,同时也会表现出对不同结构和作用机理的药物产生交叉耐受性,这种现象称为多要耐药性(multidrugresist-ance,MDR)［３］。肿瘤细胞对化疗药物产生交叉耐药是化疗成功的主要障碍,对肿瘤的治疗极为不利,也是困扰着肿瘤学家和癌症患者的一个重大问题。MDR发生机制比较复杂,但目前ABC转运蛋白(theATP-BindingCassetteTransporters)被认为是导致MDR的主要机制之一,其在肿瘤多药耐药产生中的主要作用是将化疗药物由肿瘤细胞内泵至细胞外,降低细胞内药物浓度,从而导致MDR的产生［４］,其中与临床肿瘤治疗关系最密切的是AB-CB1、ABCC1、ABCG2。建立耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段,对肿瘤的治疗具有十分重要的意义,是探讨恶性肿瘤多药耐药机制及其逆转多药耐药性的基础。本研究采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞,建立阿霉素耐药的人乳腺癌MCF-7细胞系,并检测耐药模型较亲本株的耐药倍数,细胞内药物的积累量等参数,以及多药耐药的标志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表达变化,为深入研究肿瘤耐药及多药耐药逆转提供理想的模型和实验依据。1材料和方法1.1mtt和dmso人乳腺癌MCF-7细胞系购于中国科学院上海细胞生物所,1640培养液购于康宁公司,胎牛血清购于Thermo公司,0.25%胰酶购于碧云天公司,噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny-ltetrazoliumbromide,MTT)、二甲基亚砜(Dimeth-ylsulfoxide,DMSO)购于sigma公司,阿霉素(Ad-riamycin,ADR)购于生工生物公司。1.2体外细胞u/ml链霉素检测用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的1640培养液在37℃,5%CO２饱和湿度培养箱中培养,以0.25%胰蛋白酶消化,3~5d传代1次,取对数生长期的细胞用于实验。1.3阿霉素对mcf-7/细胞增殖的抑制率及ic采用大剂量间歇诱导MCF-7细胞［５］。1取对数期生长的MCF-7细胞按8×10３个/孔接种于96孔板,每孔加190μL细胞悬液,培养24h后,加入终浓度为0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg/mL的阿霉素10μL/孔,设3个复孔;37℃、5%CO２条件下培养48h;加入5mg/mL的MTT10μL继续培养4h,弃去培养上清,每孔加入DMSO150μL摇床上摇10min,测定各孔的OD５７０值,计算阿霉素对MCF-7/细胞增殖的抑制率及IC５０。其计算公式为:细胞生长抑制率/%=[1-(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100。2取MCF-7细胞接种于6㎝培养皿中,37℃,5%CO２饱和湿度培养箱中培养,进入对数生长期后加入终浓度为0.6μg/mL(>IC５０)的阿霉素,作用12h,弃含药培养液换不含阿霉素的培养液培养数代,待细胞生长状态良好以后,按上述方法重复,直至细胞能维持在0.6μg/mL阿霉素浓度下长期培养即成为耐药人乳腺癌细胞模型MCF-7/Adm。1.4阿霉素对mcf-7/adm细胞增殖的抑制率及实验指标取对数期生长的MCF-7细胞,调整细胞密度,按每孔8×10３个细胞接种于96孔板中,每孔加190μL细胞悬液,培养24h后,加入不同浓度的ADR,其终浓度分别为0、1、5、25、125、250μg/mL,每孔总体积200μL;设对照孔为不加药物的;调零孔为不加细胞的培养液,每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5%CO２培养箱中继续培养48h,各孔加入MTT(5mg/mL)10μL,继续培养4h,弃去培养上清,每孔加入DMSO150μL摇床上摇10min,测定各孔OD５７０值,计算阿霉素对MCF-7/Adm细胞增殖的抑制率及IC５０值、耐药指数。其计算公式为:耐药指数(RI)=耐药细胞IC５０/野生型细胞IC５０。1.5阿霉素上流式细胞术检测细胞的活性取生长状态良好的对数生长期MCF-7细胞、MCF-7/Adm细胞,分别以1×10５个细胞接种于6cm培养皿中,加RPMI1640培养液培养24h后,在培养液中加入阿霉素至终浓度为5μg/mL,培养24h后,0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,冷PBS洗涤2次,在重悬于冷PBS中,上流式细胞仪检测(激发波长488nm,反射波长575nm)。1.6实时荧光定量pcr检测取对数生长期的MCF-7细胞、MCF-7/Adm细胞,分别以1×10５个细胞接种于6㎝培养皿中,加RPMI1640培养液培养72h后,收集细胞。Trizol法提取总RNA,检测其浓度和纯度。经过逆转录分别得到其cDNA,用于Real-timePCR扩增。引物如表1所示,PCR体系的总体积为20μL,其中包括ddH２06.4μL,上下游引物分别0.8μL,已稀释的cDNA2μL,SYRB10μL,置于实时定量PCR仪设置反应程序并进行PCR反应。设置反应条件为:预变性95℃10min,95℃15s,60℃1min,40个循环后收集荧光。采用2－ΔΔＣｔ法分析数据。1.6统计学处理使用SPSS17.0软件统计分析,采用t检验、方差分析,资料以均数±标准差表示。2结果2.1mcf-7细胞的形态变化通过终浓度为0.6μg/mL的阿霉素反复间歇诱导,历时8个月成功诱导出MCF-7/Adm细胞。冻存复苏后细胞仍能稳定生长、增殖。如图1,与野生型MCF-7细胞比较,耐药细胞株MCF-7/Adm的形态发生明显变化,边缘不再呈尖角梭型,相对比较圆滑。野生型MCF-7细胞之间接触比较紧密,而耐药细胞株MCF-7/Adm之间间隙比较大,排列比较松散。在培养过程中发现,耐药细胞株MCF-7/Adm消化时间较野生型稍长。2.2adm对mcf-7细胞表型的抑制作用不同浓度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/Adm细胞48h后,如图2所示,ADM对MCF-7和MCF-7/Adm细胞的抑制率都随着ADM浓度的升高而增大,但ADM对MCF-7细胞的抑制作用明显比MCF-7/Adm的强,0.02μg/mL的ADM已经对MCF-7细胞产生抑制作用,但ADM浓度增加为50倍即1μg/mL时,对MCF-7/Adm未见明显抑制作用。与MCF-7细胞相比,MCF-7/Adm细胞对ADM有明显的耐药性(表2),MCF-7/Adm细胞的耐药指数RI为324倍(P<0.01)。2.3mcf-7和mcf-7/adm细胞内阿霉素的荧光强度用终浓度为5μg/mL的ADM处理MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞24h后,流式细胞术检测MCF-7和MCF-7/Adm细胞内阿霉素荧光强度,结果如图3显示MCF-7细胞内ADM的荧光强度明显比MCF-7/Adm高,分别为98.6%和51.4%。说明MCF-7/Adm细胞内的阿霉素蓄积量明显低于MCF-7细胞,进一步说明MCF-7/Adm细胞较MCF-7细胞对阿霉素产生耐药性。2.4mcf7-adm细胞的abcg2、abcb1和abcc1基因表达水平药耐药的标志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表达Real-timePCR结果显示,与敏感细胞株MCF7相比,MCF-7/Adm细胞内ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表达有明显差异,如图4,ABCG2和ABCC1在耐药细胞中表达水平下调,而ABCB1在耐药细胞中表达水平上调。3阿霉素耐药乳腺癌细胞的活性目前肿瘤的多药耐药性仍被视为化疗中的最大障碍。各种肿瘤细胞获得耐药性的机制,都可能成为今后化疗的靶点［６］。因此,深入研究肿瘤细胞耐药性机制的产生,寻找关键的靶点,进而针对靶点设计逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物,为降低癌症死亡率和提高治愈率增加希望［７］。肿瘤耐药细胞株的建立是研究MDR发生机制和逆转策略的重要手段。可以说,目前已知的MDR机制几乎都首先在耐药细胞株中发现,而后在临床病人中得到证实的［８］。国内外学者们用药物递增诱导法建立了多种耐药肿瘤细胞株,以深入研究肿瘤耐药的机制。体外建立耐药细胞株作为研究肿瘤细胞MDR机制的重要工具至今已有20多年的历史,已产生多种诱导耐药,建立耐药细胞系的方法［５，８－９］。阿霉素(adriamycin,ADM)是目前临床上应用较为广泛的抗肿瘤药物,抗瘤谱较广,主要适用于急性白血病,对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定疗效［１０］。它是一种蒽环类抗生素,主要是通过进入细胞核固定在拓扑异构酶Ⅱα-DNA复合体上,影响细胞增值,达到杀伤肿瘤细胞的目的,对各种生长周期的肿瘤细胞都有一定的杀伤作用［１１］。研究表明,肿瘤化疗过程中长期使用阿霉素会导致肿瘤细胞对其产生耐药性,而且已经有很多阿霉素耐药细胞株构建成功的例子,所以本课题用阿霉素诱导乳腺癌细胞MCF-7,建立可靠的肿瘤细胞多药耐药性模型。本研究所采用的大剂量间歇诱导法与临床周期性化疗相似,更好地模拟临床上化疗患者出现的耐药现象,它对肿瘤多药耐药性的研究更有意义。经过此方法成功诱导得到MCF-7/Adm耐药株,其耐药指数为324。其细胞形态较野生型MCF-7细胞发生明显变化,而且在培养过程中也发现耐药株生长也相对缓慢,胰酶消化时间也较野生型稍长。MTT结果提示两株细胞对ADM的敏感性存在着显著的差异(P<0.01)。0.02μg/mL的ADM已经对MCF-7细胞产生抑制作用,但ADM浓度增加为50倍即1μg/mL时,对MCF-7/Adm未见明显抑制作用,提示MCF-7/Adm细胞对ADM产生了显著的耐药性。流式细胞术检测结果显示耐药株内阿霉素浓度明显降低,这进一步说明耐药细胞株构建成功。Real-timePCR结果显示耐药细胞内AB-CB1基因表达上调,而ABCC1基因和ABCG2基因表达下调。初步推断其产生耐药性与ABCB1基因表达上调有关,ABCB1导致肿瘤多药耐药主要是将化疗药物由肿瘤细胞内