ez-n5转座复合物的电转化及对抗菌药物敏感性研究

ez-n5转座复合物的电转化及对抗菌药物敏感性研究

现在，细菌抗剂的现象非常严重。随着广光谱高效抗剂的广泛使用和滥用，以及选择压力下泛服药铜绿假单胞菌、泛棕榈醇非生菌和泛丙烯酸肺炎克隆比菌的情况，在开发新旧药物的使用中，必须充分了解各种抗药性药物的抗剂机制。一般肠杆菌科的耐药机制:细菌产生灭活酶或钝化酶对抗菌药物的灭活与修饰;抗菌药物作用靶位的改变;膜对抗菌药物的通透性下降,药物摄入减少;膜对抗菌药物的主动外排,药物排出增加;细菌形成生物被膜等。我们常用的研究细菌耐药机制的方法是出现一种新的耐药表型后,再研究该表型背后的基因机制。但是在一种新的耐药机制出现之前,这种方法则无从下手,显得十分被动。En-Tn5转座子试剂盒能够随机、单拷贝、稳定地插入细菌基因组,从而造成一系列携带单拷贝转座子插入的克隆子,给研究人员提供了依次灭活细菌基因组基因的途径。本研究即利用En-Tn5试剂盒的这一特征,构建一系列单基因转座子灭活文库,然后用抗菌药物(除氨基糖苷类外)进行克隆子药敏试验,以期从筛选到的药敏表型的克隆子中发现新的耐药机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和颗粒大肠埃希菌标准菌株BL21,质粒pUC19购自上海申能博彩公司。1.1.2座混合物tnptranspos其4购自EpicentreBiotechnologies公司。EZ-Tn5转座复合物[EZ-Tn5TM(R6Kγori/KAM-2)TnpTransposomeTMKit]是由EZ-Tn5转座子和其相应的转座酶组合所形成的稳定复合物。EZ-Tn5转座子中含有一个带有卡那霉素抗性标记的基因片段。1.1.3抗菌纸片标准品LB培养基、10%甘油、氨苄西林抗性平板、卡那霉素抗性平板、SOC培养基均参照文献自行配制。M-H琼脂,K-B纸片为英国Oxoid公司产品。38种抗菌纸片标准品均购自上海药检所。细菌基因组DNA抽提试剂,限制性内切酶BamHI、XbaI,T4连接酶试剂盒,LATaq酶试剂盒购自大连宝生物TaKaRa公司。胶回收试剂盒购自上海生工生物技术公司,质粒小提试剂盒购自TIANGEN公司,pUC19筛选平板为含50μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板,EZ-Tn5转座复合物转化子筛选平板为含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。1.2方法1.2.1抗菌药物平板制备由于En-Tn5试剂盒昂贵,本研究用质粒pUC19转化大肠埃希菌BL21,以初步探索最佳转化效率。按照最佳效率的转化条件,稍加改良,将转座子EZ-Tn5转化BL21:挑取血平板上新鲜大肠埃希菌BL21纯菌落2～3个,接种LB培养基,37℃,200r/min离心,振荡培养至0.8OD。4℃下,7000r/min离心10min集菌。去上清,沉淀用冰预冷的10%甘油溶液重悬。再4℃,7000r/min离心10min洗涤细菌1次。沉淀加入约150μl的冰冷的10%甘油制备感受态细胞。取100μl感受态细胞、1μl转座子Tn5,加入预冷的2cm电转化杯中。在Bio-Rad电穿孔仪上,以2.7KV电压电击,立即加入900μl37℃预温的SOC培养基,复苏培养1h。菌液用SOC培养基按不同比例稀释后取100μl涂布于50μg/mlKan抗菌药物平板,37℃培养16～18h,收获克隆子。阴性对照除不加转座子外,过程与试样相同。1.2.2k-b药敏试验本研究共获得182株克隆子,每株克隆子都用37种抗菌药物进行K-B药敏试验。37℃培养16～18h测定抑菌圈直径,根据CLSI2009抗菌药物敏感性试验执行标准判读结果。1.2.3ez-tn5基因抽提BLmU29菌株的基因组DNA。根据EZ-Tn5结构,用BamHⅠ酶切BLmu29菌株基因组DNA,使细菌基因组被切成零碎片段,EZ-Tn5转座子上还有一个BamHⅠ多克隆位点,因此一定会有一片段含有EZ-Tn5序列,用T4酶使片段自连接成为环状DNA。酶切连接产物65℃灭活10min后作为模板,以EZ-Tn5反向PCR引物(KAN-2FP-1:5′-ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC-3′及R6KAN-2RP-1:5′-CTACCCTGTGGAACACCTACATCT-3′)进行反向PCR,琼脂糖电泳分离纯化PCR产物。反向PCR产物送上海英骏公司采用Walking法测序,测序引物为R6KAN-2RP-1InversePrime:5′-CTACCCTGTGGAACACCTACATCT-3′与Walking引物:5′-ACAGTTTTGTGCGTTTCTCG-3′。根据测得的DNA序列确定转座子插入位点。见图1。2结果2.1电转化最佳条件的确定根据质粒pUC19电转化大肠埃希菌BL21的结果,发现在菌液OD值为0.8以及转化电压为2.7KV的时候,电转化的效率最高达到每μgDNA转化得到7.2×107个克隆子。最后确定大肠埃希菌BL21电转化最佳条件为:(1)感受态细胞需新鲜制备。(2)在菌液OD值为0.8(600nm)时进行感受态制作。(3)缓冲体系为10%甘油缓冲液。(4)电击电压为2.7KV,时间4.3s。按照这个条件,将EZ-Tn5转座复合物转化入感受态细胞后,共获得182株转化成功的大肠埃希菌克隆株。见表1。2.2菌株的抑菌圈直径、扩增量182株克隆株及阴性对照株分别进行37种不同抗菌药物纸片K-B法药敏试验。其中29号克隆子对青霉素的抑菌圈直径从12mm扩展到17mm,见图2。根据CISL2008标准,菌株从敏感变为耐药,见表2。突变菌株命名为BLmu29。通过6次重复的药敏试验,抑菌圈直径大小稳定在17mm,可确定此表型的改变可以被稳定遗传。2.3ez-tn5转座子插入位置通过对BLmu29基因组DNA进行的反向PCR,本研究获得约1000bp产物;反向PCR产物片段DNA序列经过与原转座子序列Blast比对,结果证实此PCR扩增产物确实含有EZ-Tn5转座子插入位点。再根据重合序列所在位置周围序列与大肠埃希菌BL21原序列作Blast比对,可寻找到转座子插入的位点位于细菌基因组1736位点,而BL21基因组原序列中:544～2977位点为编码甘油-3-磷酸酰基转移酶的基因。可以得出结论,转座子插入大肠埃希菌BL21基因组中甘油-3-磷酸酰基转移酶所在基因位点,破坏了此基因的读码框,从而影响甘油-3-磷酸酰基转移酶的表达。见图3。3甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的灭活作用各种抗菌药物的作用机制是在不同的阶段抑制或破坏细菌体生命运转的关键步骤而杀死细菌,我们熟知的耐药机制有外膜通透性缺陷,外排泵活性异常,各种抗菌药物水解酶作用靶位改变等。因此为充分了解本研究组获得的182个克隆子耐药表型的变化,本研究采用了华山医院临床上常用的所有抗菌药物的,以期尽可能多的观察到被灭活的基因对细菌耐药表型的影响。本研究所使用的Tn5转座子本身带有卡那霉素抗性基因,对耐药有一定协同作用,故去除了常用氨基糖苷类抗菌药物。182株突变株中,其中BLmu29株对青霉素的抑菌圈发生了从耐药到中介的变化,除此之外,对头孢唑林、头孢克洛、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢他啶、万古霉素以及呋喃妥因的抑菌圈直径也有不同程度的增加。本研究中的插入突变使用的是EZ-Tn5转座子,长度约为1kb,故其插入基因所在读码框后,基因便永久失活,重复实验之后可以确定这种变化能被稳定的遗传下去。在进行了反向PCR并且测序之后,发现了转座子的插入点是在大肠埃希菌基因组的1736位上,确定基因组中的表达甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因被灭活。甘油-3-磷酸酰基转移酶是存在于大肠埃希菌外膜上的一种蛋白,催化脂肪酰基基团从酰基辅酶A或酰基ACP上转移到甘油-3-磷酸的1位上,合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸,并能提供酰基载体蛋白的结合位点。酰基载体蛋白在大肠埃希菌的脂肪酸及磷脂的合成和之后的代谢都起着重要作用。由于转座子的随机插入突变,很可能致使此酶合成缺陷,继而导致细菌细胞膜合成受阻,细胞膜通透性增强,使青霉素等各种亲水性抗菌药物进入菌体量的增加,从而不同程度地增加其抗菌活性。本研究提示,甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的灭活能够影响细菌对亲水性抗菌药物的耐药性,推测可