链脲佐菌素结合高糖高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型的建立

链脲佐菌素结合高糖高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型的建立

随着社会老龄化和生活方式的改变，2型糖尿病（t2dt）的发病率逐年增加。糖尿病的病因至今尚未完全阐明,目前认为主要是胰岛素抵抗(IR)、胰岛β细胞功能衰竭和胰岛素分泌障碍,而胰岛素抵抗(IR)是T2DM的重要特征。为研究糖尿病形成的病因,利用合适的糖尿病动物模型无疑可对人类糖尿病研究提供重要线索,可以解决许多在糖尿病患者临床上所不能解决的问题,因而是十分必要的。目前,国内多采用链脲佐菌素加高脂高糖饲料喂养法复制T2DM模型。以往的研究报道中,高脂高糖喂养时间为4周到10周不等,STZ注射剂量为25~90mg/(kg·bw),高脂高糖喂养时间过长,导致试验周期过长;STZ剂量偏大,试验动物胰岛β细胞破坏过多,则更倾向于Ⅰ型糖尿病的表型特点,影响研究结果,而且死亡率增加。该试验通过喂饲高脂高糖饲料4周加链脲佐菌素[30mg/(kg·bw)]对大鼠进行腹腔注射,建立一种较佳的类似人类T2DM的动物模型。通过RT-PCR方法检测大鼠胰腺组织磺脲类药物受体1(sulfonylureareceptor1,SUR1)mRNA的表达,初步探讨糖尿病发病的分子机制。1材料和方法1.1性别间的合作SPF级SD大鼠,体质量(200±20)g,30只,雄性。购于广州中医药大学实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2008-0020。1.2仪器和试剂链脲佐菌素(STZ,晶欣生物科技公司,LOT:120705)、胰岛素(Insulin,INS)ELISA试剂盒(CUSABIOBIOTECHCO.,LTD,LOT:U28071539)、血糖检测试剂盒(四川迈克生物科技股份有限公司,批号:1010131)、cDNA试剂盒(Fermentas公司,LOT:00093395)、Trizolreagent(Invitrogen公司,LOT:15596-026)、氯仿(>99.8%)美国Sigma公司,LOT:20110802-1)、DL2000DNAMaker(博大泰克MK-4,LOT:039)、AgaroseLE(MDBio,Inc.西班牙,LOT:NO.111760)、TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司,E2300)、EB(广州威佳科技有限公司,LOT:136318431108049)、Tris(TheDowChemicalCompany,LOT:W422000)、EDTA·2Na·2H2O(MBCHEM,LOT:2246122)、冰醋酸(广州化学试剂厂,20110601-2)、DEPC(diethylpyrocarbonate,焦碳酸二乙酯,美国Sigma公司,LOT:110610)、引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。1.3pcr扩增及成像系统简介电子血糖分析仪(OneTouchUltra,稳豪血糖仪)、全自动生化仪(日立,7096型)、超纯水系统(美国Millipore,Rios5+Milli-Q-B)、多功能PCR扩增仪(美国ThermoHybaid,PXⅡ)、电泳系统(美国BIO-RAD,Mini-SubCell)、凝胶成像及分析系统(美国BIO-RAD、GelDoc)、酶标仪(美国ThermoLABSYSTEMS)、超低温冰箱(美国ThermoForma,702)。1.4花东信华动物养殖场普通饲料及高脂饲料均购于广东省广州市花都区花东信华实验动物养殖场。高脂高糖饲料配方:18%猪油、20%蔗糖、3%蛋黄粉、59%基本饲料。1.5方法1.5.1组将30只SPF级SD大鼠购回后,适应性喂养1周,无异常发现者,随机分成2组:正常组10只,模型组20只。1.5.2stz的注射空白组大鼠给予普通饲料,模型组大鼠给予高脂高糖饲料,喂养4周。4周后将STZ组大鼠禁食不禁水12h后,腹腔注射STZ[30mg/(kg·bw)]。STZ注射5d后,对注射STZ的大鼠测定尾静脉随机血糖,认为随机血糖>16.7mmol/L者为2型糖尿病造模成功。1.5.3rt-pcr检测每日8:00—10:00对大鼠进行一般状态观察。每周记录1次体质量。大鼠腹腔注射10%水合氯醛,眼眶静脉丛采血,3000r/min,离心10min,取上清,-80℃冰箱保存。检测注射STZ后1、4、8、12周的空腹胰岛素(INS)、血糖(BG)的含量,计算胰岛素敏感指数(insulinsensitivityindex,ISI)。其中,BG测定用全自动生化分析仪检测,INS测定用ELISA方法,具体按说明书操作,根据酶标仪检测得到样品的吸光值(检测波长为450nm),利用标准曲线的二次方程式计算得出待检样品中INS的浓度。12周麻醉后处死动物,剥离并摘取胰腺,迅速提取总RNA,检测浓度后进行RT-PCR检测SUR1mRNA的表达。设β-actin为内参照。取40μg/mL的RNA,反应体系为25μL,循环参数:95℃3min,94℃30s,54℃30s,72℃45s,72°C10min,共33循环进行RT-PCR。取5μLRT-PCR产物,经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,利用凝胶成像系统扫描分析SUR1基因与内参β-actin的光吸收比值。RT-PCR引物用primerpremier5.0软件设计,由上海生物工程技术有限公司合成,序列为SUR1的上游引物5′AGAGCGAGGAAGATGACA3′,下游引物5′ACAGTGACAGAGGTGACA3′,预期大小322bp;β-actin的上游引物5′CCATTGAACACGGCATTG3′,下游引物5′TACGACCAGAGGCATACA3′,预期大小234bp。重复检测3次。1.5.4统计处理2结果STZ注射后,有2只大鼠未成模,模型组有3只大鼠死亡。2.1大鼠的一般状态2.2体重和体重变化喂养4周后,空白组体重(321.63±26.59)g,模型组体重(346.63±34.44)g,与空白组比较,体重增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。注射STZ后,模型组相应时间点的体重比空白组轻,但差异无统计学意义(P>0.05)。两组大鼠体重比较结果见表1。2.3g、isi检测注射STZ后1、4、8、12周,模型组BG值均明显升高,与空白组比较,P<0.01;ISI均明显降低,与空白组比较,P<0.01。两组大鼠血糖及胰岛素比较结果见表2。2.4从反应的方法上看RT-PCR扩增β-actin、SUR1基因片段后,20g/L琼脂糖凝胶检测到234bp和322bp2个条带的产物(见图1和图2)。通过凝胶成像扫描系统做半定量分析,以SUR1mRNA与β-actin的吸光度比值作为该产物的绝对值。结果显示(见表3),细胞内的SUR1mRNA含量模型组明显低于空白组(P<0.01)。3sur1基因多态性对tmd的影响T2DM的发病机制包括胰岛素抵抗和β细胞分泌功能障碍,英国对糖尿病的前瞻性研究表明,β细胞功能衰退是T2DM发生和进展的主要驱动力,因此,研究β细胞功能相关基因具有重要意义。已有研究表明,有多种基因与β细胞功能相关,如SUR1基因、解偶联蛋白2基因、胰高血糖素样肽1基因等。SUR1基因是胰岛β细胞膜ATP敏感钾通道(KATP)的调节亚单位。它在胰岛素释放过程中有生理性调节作用,当血糖浓度波动,使细胞内ATP/ADP比例改变时,可通过SUR1基因调节ATP敏感的钾通道开关,进而影响胰岛素的分泌,成为胰岛素分泌缺陷和2型糖尿病易感性的潜在候选基因。在对SUR1基因的多态性与T2DM发生发展过程中的作用还存在争议,国外对它与T2DM具有或不具有相关性的结论均有报道,对中国汉族人群的研究结果也不尽一致,还需要进行更大样本的糖尿病人群的研究,以明确该基因是否为T2DM的易感基因之一。该研究中,采用高脂高糖饲料喂养4周后,一次性腹腔注射STZ[30mg/(kg·bw)],5d后,对注射STZ的大鼠测定尾静脉随机血糖,认为随机血糖>16.7mmol/L者为2型糖尿病造模成功,成模率为75%,与文献报道结果接近。注射STZ后1~12周,模型组BG均明显升高,ISI均明显降低,符合2型糖尿病的特点。通过RT-PCR方法检测注射STZ后第12周SUR1mRNA表达的变化,发现模型组SUR1mRNA表达明显下降,与空白组比较P<0.01。可能是由于STZ直接破坏胰岛β细胞,使得胰岛内β细胞数目大大减少,同时β细胞的生理功能也会受到影