法国枳桐花粉变应原纯化及主要变应原免疫活性分析

法国枳桐花粉变应原纯化及主要变应原免疫活性分析

法国梧桐花是春天重要的过敏花粉。近年来，她被列入春季花粉过敏组，进行诊断和脱敏治疗，但对过敏成分的国内研究甚少。本研究拟对其变应原组分进行分离纯化并分析其免疫活性,为今后进一步制备单抗及基因工程生产花粉变应原奠定基础,从而提高过敏性哮喘的诊治水平。1对象和方法1.1哮喘诊断标准收集我院变态反应专科门诊法国梧桐花粉过敏性哮喘患者7例,其中男性3例,女性4例。哮喘诊断根据全国第二届哮喘会议制定的标准。法国梧桐花粉过敏的诊断,根据典型的花粉过敏病史,法国梧桐花粉变应原皮内试验风团直径≥++。1.2方法1.2.1法国梧桐粉素浓缩液的制备于3月中旬至4月上旬采集当地纯净法国梧桐花粉,9号分样筛除杂质,乙醚脱脂。1.2.2柱内充填法提取液称取SephadexG-10015g于蒸馏水350mL中溶胀。将糊状的SephadexG-100凝胶一次倾入洁净层析柱中,使之自然沉降。待凝胶沉积后,将多余的溶剂放出,将浓缩的粗制液2mL加至凝胶柱上,打开管夹,使粗制液流入柱内,连接恒流泵,加入0.1mol·L-1pH7.4PBS洗脱,用核酸蛋白质仪监测洗脱情况,得洗脱曲线,有两个峰,分别收集峰1的升段、峰段、降段、峰2升段。峰2降段富含色素,只含微量蛋白,弃之。重复上述洗脱过程,经浓缩、透析、离心,将浓缩后各段洗脱液混合收集,4℃冰箱冷存备用。1.2.3预测凝胶层压电泳取标准蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL进行SDS电泳,采用不连续PAGE,110g·L-1分离胶,50g·L-1浓缩胶,电极缓冲液pH8.3。电泳在室温中进行,电压为150V,染料迁移至凝胶下端处,停止电泳。将凝胶片取出,染色1h,倾出染色液,用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液,数小时换液一次,直到背景清晰。根据标准管分子质量计算各组分蛋白质相对分子质量(Mr)。1.2.4凝胶的“东南角”切取电泳凝胶相同大小的聚乙烯二氟膜(PVDF膜),以电转移缓冲液润湿,分别放在电泳后的凝胶上,用润湿的Whatman3mm滤纸支持,将第二块润湿的滤纸贴在凝胶的另一面,形成一套夹心的“三明治”。将“三明治”放置在两块充分浸润的泡沫垫之间,置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内,电泳2h,取出PVDF膜夹在两张滤纸之间干燥。1.2.5兔抗人igg-hrp、兔抗人ige-hrp的制备将PVDF膜切成2mm宽的条带分别置于转移槽中,用PBS缓冲液洗3次,用含40g·L-1脱脂奶粉封闭,置于摇床摇约1h,再用PBS缓冲液洗3次,然后各加入50μL阳性血清,37℃摇动3h,用PBS缓冲液洗3次后分别加入兔抗人IgG-HRP、兔抗人IgE-HRP5μL,37℃摇动1h,再用PBS缓冲液洗3次。加底物溶液反应至抗原区带呈现紫色后终止反应,将PVDF膜夹在滤纸中干燥,成像后暗处保存。2结果2.1l-1ph对小鼠血清中蛋白质的提取浓缩法国梧桐花粉粗制液过SephadexG-100层析柱,用0.01mol·L-1pH7.4PBS洗脱,洗脱曲线(图1)为两个峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,第二峰降段含有大量色素,蛋白含量甚微,弃之。收集第一峰及第二峰升段洗脱液。2.2蛋白区带及分子质量SDS结果取标准蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL进行SDS,结果见图2。从图2中可见,10余条深浅不一的蛋白区带,分子质量主要介于16～17ku之间。其中6条带蛋白含量较多,分子质量分别为71、50、35、39、22、16ku。第一峰升段、峰段、降段电泳图相似,主要含分子质量22～71ku之蛋白质,第二峰升段以分子质量为14～16ku之蛋白质为主。2.3免疫试验的结果7例法国梧桐花粉过敏的哮喘患者免疫印迹检测均有阳性区带出现(图3),而无法国梧桐花粉过敏的哮喘患者血清呈阴性反应,无反应区带出现。3蛋白分子质量及免疫印迹检测法国梧桐又称二球悬铃木,为落叶乔木,属悬铃木属。原产于欧洲,我国于60年代后大量栽培作行道、公园、庭院等绿化树种,目前广布各地,其中以法国梧桐最多见,其花期为4月中旬至5月上旬,花粉产量很大,风媒传播,在花期空气中花粉含量很高。由于体积微小,极易被吸入呼吸道引起变态反应性疾病。由于花粉变应原浸液中含有无变应原作用的物质和对机体有刺激作用的成分,因此有必要分离纯化花粉主要变应原并确定它们的成分和免疫学特性。多数学者采用凝胶层析分离变应原蛋白,PuttonenE等用凝胶层析法葡聚糖凝胶SephadexG-75分离桦树花粉变应原,变应原活性主要在分子质量为10～15ku蛋白质之间。国内龙如章等用SephadexG-75分离银杏树花粉变应原,分子质量30～42ku蛋白质为主要变应原成分。本研究采用SephadexG-100将法国梧桐花粉进行层析,得两个洗脱峰,经SDS检测各段蛋白质分子质量,结果表明,第一峰蛋白质含量高,分子质量为22～71ku,第二峰升段以分子质量14～16ku之蛋白质为主,第二峰降段仅有弱染色带,说明此部分蛋白质分子质量低于14ku。免疫印迹(Westernblot)是70年代末在核酸印迹的基础上发展起来的一种检测蛋白质的分子生物学技术。此法综合了凝胶电泳高分辨率和固相免疫敏感、特异等多种优点,不仅可以对蛋白质抗原进行定性、半定量分析,而且可以从混杂蛋白质中检测特定的抗原并测定其分子质量,适合于变应原特性成分的分析,尤其适用于主要变应原及次要变应原的检测。孙秀珍等用免疫印迹法对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行分析,结果发现分子质量100、76、35、28、8ku的蛋白是葎草花粉过敏性哮喘患者的致敏成分。本研究对法国梧桐花粉变应原的免疫印迹分析表明,有4条蛋白带能与梧桐花粉特异性IgG结合,其分子质量为50、39、22、16ku,说明梧桐花粉含有多种致敏成分。自1996年Ishizaka等发现IgE后,它一直被认为是介导Ⅰ型变态反应的主要抗体。近年来,不少研究发现血清免疫球蛋白IgG参与Ⅰ型变态反应,起着过敏性抗体的作用(主要是IgG4)。Etievant等在屋尘螨脱敏治疗的哮喘患者中发现IgG4降低者症状缓解。Nahm等测定尘螨过敏性哮喘