松材线虫传入与扩散的木包装材料的初步研究

松材线虫传入与扩散的木包装材料的初步研究

由于松材线虫，松树萎缩已在日本、韩国、中国和其他国家造成重大影响。未处理的木材碎片是松材线虫长距离传播和传播的主要方式。松材线虫于20世纪初进入日本,部分亚洲国家也于上世纪80年代中后期陆续报道发现松材线虫。1984年,芬兰植物检疫机构从进口的松木包装中截获松材线虫后,立即出台植物检疫措施禁止来自松材线虫疫区未经处理的松木进入芬兰。1985年,欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)将松材线虫列为检疫对象。1999年,欧盟的葡萄牙首次发现松材线虫,并认为松材线虫很可能是通过进口的木质包装传入葡萄牙的。2003年3月,联合国粮农组织(FAO)出台了国际贸易中木质包装材料管理准则(ISPM15:FAO,2003)。该准则描述了全球公认的处理方法,以减少和消除绝大多数木质包装材料携带的检疫性有害生物带来的风险。从2006年1月1号起,我国要求所有进境的针叶木和非针叶木包装材料必须按照ISPM15进行检疫除害处理并加施标记。为防止检疫性有害生物的传播和扩散,我国还对部分出入境船舶的铺垫木质包装材料实施检疫。2005年10月,宁波出入境检验检疫局植检实验室从一批出境船舶铺垫材料中检出1种伞滑刃属线虫,对此进行了形态学和分子鉴定。据了解,该批铺垫材料为贝壳杉(Agathisdammara),来自马来西亚。现将鉴定结果报道如下:1材料和方法1.1样本采集用锯子将数块该批铺垫材料锯成小段,编号后用塑料袋密封,标记,带回实验室检测。1.2线虫繁殖、鉴定1.2.1线虫分离采用改良漏斗法进行线虫分离。将木样劈成长约100mm、宽约10mm左右的薄片,置于漏斗中,加入适量水(以淹没薄片为宜),25℃恒温培养24h后,用表面皿接取5～10mL线虫分离液,镜检。1.2.2线虫纯培养将30余条线虫挑入无菌蒸馏水中漂洗3次,移入长满灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA培养基中。10d后,繁殖获得大量的线虫。1.2.3永久玻片制作将杀死的线虫液移至装有200μL的线虫固定液Ⅰ(96%乙醇∶甘油∶水为20∶1∶79)的500μL小离心管中,将小离心管放在装有96%乙醇的干燥器内(乙醇占干燥器体积的十分之一左右),37℃下持续12h以上。取出离心管,简单离心,弃上清,加固定液Ⅱ(甘油∶96%乙醇为5∶95),简单离心,以免线虫贴在壁上。打开盖子,放在不完全关闭的陪替氏皿(Petridish)中维持在40℃,直到线虫完全被甘油浸透。在干净载玻片上加封片蜡圈,用挑针加1滴甘油于蜡圈中心。吸取脱水的线虫于玻片上,在解剖镜下挑取脱水后的线虫于甘油中,使线虫沉于中心位置。在蜡圈上放置盖玻片,转移至控温电热平板上,保持65℃使蜡完全融化,自然冷却后用透明指甲油加封1次。获得的永久玻片进行拍照、形态鉴定。1.2.4线虫种类鉴定用ZeissAxioskop40显微镜和LeicaDFC320数码相机对线虫的整体形态和内部特征进行观察、摄影,并用DeMan公式法进行形态特征测计。根据形态特征和测计结果,结合相关文献,对该线虫种类进行初步鉴定。1.3比较的相似课题对截获的线虫与其他松材线虫组近似种进行形态学比较研究。1.4pcr扩增及电泳检测1.4.1线虫DNA提取取一干净载玻片,上滴15μL左右的ddH2O,挑取1～5条线虫放入其中,用洁净的解剖刀将线虫切成2～3段,然后吸取含有这些线虫片断的悬浮液10μL,加入含有8μL预冷WLB液的1.5mLEppendorf管中,并向管中加入2μL600μg·mL-1蛋白酶K,编号标记后放入-70℃冷藏箱低温冷冻数小时(或过夜)。将冷冻后的线虫取出,迅速放入PCR仪中(或水浴锅中),65℃条件下保温2h,分解线虫的蛋白质;释放DNA。95℃条件下保温10min,使蛋白酶K失去活性。1.4.2PCR扩增将上述反应的产物(DNA模板)8μL加入到PCR管中,加入相关试剂,建立50μL的反应体系:1×PCRBuffer;2.0mmol·L-1MgCl2,0.1mmol·L-1dNTP,0.6μmol·L-1上游引物(5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’)(Ferris等),0.6μmol·L-1下游引物(5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’)(Vrain等),2UTaq酶。在PCR仪中扩增反应程序为94℃,2.5min;94℃40s,57℃40s,72℃1.5min,40个循环,72℃,5min。1.4.3电泳检测PCR目的产物的质量使用1%的琼脂糖凝胶电泳,上样量5μL,Marker为DL20005μL。稳定电压10V·cm-1,电泳30min,电泳结束后用EB染色10min,在紫外灯下观察凝胶,以电泳条带的亮度确定PCR产物的浓度和纯度,目的片断大小应该为1kb左右。1.4.4PCR产物酶切分别用RsaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和AluⅠ5种限制性内切酶对PCR产物进行酶切。向200μL的PCR管中加入0.5μL限制性内切酶、1.0μLBuffer、2.5μL去离子水、6μLPCR产物,放入PCR仪中,37℃条件下保温3h。然后电泳,marker为100bpDNAladder,凝胶浓度为2%,其他同1.4.3。凝胶成像,获得线虫的ITS-RFLP指纹图谱。2结果与分析2.1测量值具体测量值见表1。2.2大小核型各使用不同的方式考察精母细胞的生长情况形态描述见图1.雌虫:虫体细长,热杀死后略向腹面弯曲。表皮有细环纹。唇区高约4μm,宽约9μm,缢缩显著。口针细弱,长约15～16μm,基部略增厚,杆部占口针长的2/3。食道前体部圆柱形,中食道球发达,卵圆形或近梨形,瓣门位于中部靠前。食道腺从背部覆盖肠,长约2～3个体宽。神经环位于中食道球后1/4体宽。单卵巢前伸,约占1/2体长。卵母细胞多行排列。具阴门盖,长约8μm。后阴子宫囊长约为肛阴距的2/3,可贮存精子。尾细长,略向腹面弯曲,呈弯刀形,末端不规则,粗糙,呈缺刻状,有时有较短的尾尖突。雄虫:体前部与雌虫近似。热杀死后身体弯曲呈“J”形,精巢伸展,约占1/2体长。精母细胞多行排列。交合刺成对,较大,弓形,喙突尖刺状,基顶突有时略向背面弯曲,远端具盘状突。尾端强烈向腹面弯曲,爪状,具交合伞,多数为铲形,有3个突起。2.3两组伞滑城线虫的形态该线虫明显属于松材线虫组:雄虫交合刺较大,弓状,远端有盘状突,雌虫有较长的阴门盖。该线虫与新加坡伞滑刃线虫最接近,与松材线虫B.xylophilus、拟松材线虫B.mucronatus、锥尾伞滑刃线虫B.conicaudatus、伪伞滑刃线虫B.fraudulentus、豆伞滑刃线虫B.doui、B.luxuriosae有一定区别。该线虫的形态、测量值与新加坡伞滑刃线虫最相近(表1),但该线虫交合刺长约35～43μm,比新加坡伞滑刃线虫交合刺41～48μm略小。其雌虫和雄虫的尾均较长,雌虫尾末端多数有缺刻,而新加坡伞滑刃线虫尾末端钝圆,有短尾尖突。该线虫交合刺较大,与豆伞滑刃线虫交合刺34～43μm接近,但豆伞滑刃线虫的雌虫靠腹面末端有2～4μm的尾尖突。锥尾伞滑刃线虫的交合刺较小,仅23～28μm,雌虫有长约2～3μm的尾尖突位于腹面。伪伞滑刃线虫、松材线虫、拟松材线虫的交合刺为21～34μm,其雌虫尾部形态也与该线虫有明显的区别。该线虫雌虫末端形态与B.luxuriosae最接近,但B.luxuriosae交合刺仅27～30μm,且阴门位于虫体的71%处(该线虫阴门位于虫体的75～76%处)。2.4新加坡伞滑刀线虫的图谱将获得的PCR-RFLP图谱与所有近似种比较,发现其与新加坡伞滑刃线虫的图谱最接近(图2,表2)。两者之间用HaeⅢ酶切获得的条带有差异,关于这一现象在研究新加坡伞滑刃线虫时已发现,这是由于rDNA基因的多样性造成的。3两种伞滑材料的形态差异从形态学角度,该线虫起初被怀疑是伞滑刃属新种,但从形态学与分子生物学结果综合判断,尤其是与新加坡伞滑刃线虫的ITSrDNA序列十分接近,因此,初步确定该线虫为新加坡伞滑刃线虫。可能是由于寄主种类、生活环境的差异,造成了该线虫在形态上与新加坡伞滑刃线虫较明显的差异,如雌雄虫的尾长、交合刺大小、雌虫尾端形态等。新加坡伞滑刃线虫是本实验室于2003年从新加坡进境的阔叶木包装中截获的新种,这次又从马来西亚的贝壳杉中重新发现该线虫,说明该线虫的分布、寄主范围都比较广泛,其生物学特