灭菌与空气净化

第四章发酵工业的无菌技术

4.1发酵工业的无菌技术一、几个概念1、灭菌：用物理或化学方法杀死或除去物料或设备中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。2、消毒：用物理或化学方法杀死空气、容器内外及环境中的病原微生物，一般只能杀死营养细胞。3、除菌：用过滤的方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。二、常用的无菌技术和方法1、干热灭菌法2、湿热灭菌法3、射线灭菌法4、化学药剂灭菌法5、过滤除菌法4.2发酵培养基及设备管道灭菌4.2.1湿热灭菌原理一、微生物的热阻

1、致死温度：杀死微生物的极限温度

2、致死时间：在致死温度时，杀死全部微生物所需的时间

3、热阻：指微生物在某一特定条件（温度和加热方式）下的致死时间

表4-3几种微生物对湿热的相对抵抗力微生物名称大肠杆菌细菌芽孢霉菌孢子病毒相对抵抗力

130000002～101～5二、微生物的热死规律——对数残留定律实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：由上式可知灭菌时间取决于污染程度N0、灭菌程度Nt和K值。①一般只考虑细菌的芽孢作为计算依据。②如果要求达到彻底灭菌，即Nt＝0则所需灭菌时间t∞，这在实际生产上不可行。在实际设计时常采用Nt＝0.001，即在1000批次灭菌中有一次失败。③反应速率常数K是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。4.2.2培养基灭菌温度和时间的选择

——高温短时灭菌法在化学反应的一级反应动力学类型中，当其他条件不变时，反应速率常数与温度的关系可用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程表示：由于杂菌死亡属一级动力学反应，在灭菌时，当温度由T1升到T2，灭菌速率常数K和培养基成分破坏速率常数K’都变化。灭菌速率常数K值在T1、T2时分别为：将两式相除并取对数得：

(1)

同样，大部分培养基营养成分的破坏为一级分解反应，灭菌时培养基营养成分的破坏也可得类似关系：

(2)将式（1）和式（2）相除得：由于杀死细菌芽孢的活化能E大于营养成分破坏的活化能E‘，因此>，即随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于营养成分破坏速率常数增加的倍数，也就是说温度升高，杂菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间，并减少培养基营养成分的破坏，这就是通常说的“高温短时灭菌法”。4.2.3培养基的灭菌方法分批灭菌液体培养基连续灭菌固体培养基：转鼓式灭菌机灭菌分批灭菌也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是指将配制好的培养基输入发酵罐内，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程

。在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。（1）灭菌前的准备（2）进料（3）灭菌①升温②保温③降温连续灭菌也称连消，指培养基在向发酵罐输送的同时，在罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入空消后的发酵罐的灭菌法。连续灭菌的流程有3种：

（a）喷射加热连续灭菌流程（b）喷淋冷却连续灭菌流程（c）薄板换热器连续灭菌流程（3）固体培养基灭菌固体培养基也和液体培养基一样，要先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差不易翻动，吸水加热容易成团，冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容器。转鼓以0.5～1r/min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。

连续灭菌与分批灭菌的比较（1）连续灭菌的优缺点优点保留较多的营养质量容易放大较易自动控制；缩短灭菌周期；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；缺点设备比较复杂，投资较大，染菌几率大，对蒸汽要求高，不适用大量固体物质的灭菌。（2）分批灭菌的优缺点优点设备投资较少染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。4.2.4设备和管道的灭菌1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌2、空气总过滤器和分过滤器灭菌3、种子培养基实罐灭菌4、发酵培养基实罐灭菌5、发酵培养基连续灭菌6、补料实罐灭菌4.2.5影响培养基灭菌的其他因素影响培养基灭菌除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌时间和温度外，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。（1）培养基成分油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。（2）pH值培养基pH为6.0～8.0时，微生物耐热性好，pH＜6.0时氢离子容易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡，所以培养基的pH值越低，灭菌所需时间越短。（3）培养基的物理状态颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。当培养基中有直径大于1mm的颗粒物则明显影响灭菌效果，蒸汽很难渗透到颗粒内部，称为“灭菌不透”，应过滤除去。（4）泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。

（5）微生物细胞的含水量含水越多，微生物越易死亡（6）微生物细胞的菌龄菌龄越老则越不易死亡（7）空气排除情况空气排出越彻底，微生物越易死亡4.2.6灭菌时间的计算（1）分批灭菌时间的计算【例4-1】

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速率常数为1.8min－1。求灭菌失败机率为0.001时所需的灭菌时间。有一发酵罐，内装80m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢数为1.25×107个，大肠杆菌为5×107个，霉菌为2.5×107个121℃时灭菌速率常数为0.0287s－1。试求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。（2）连续灭菌时间的计算【例4-2】若将例3-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，此温度下灭菌速率常数为15min－1，求灭菌所需的维持时间。4.3空气除菌4.3.1空气除菌的方法1、加热灭菌2、静电除菌3、介质过滤除菌4.3.2空气过滤除菌的原理和介质按照过滤除菌机理不同，过滤除菌分为：1、绝对过滤：尘埃或M直径＞过滤介质孔径2、相对过滤：尘埃或M直径＜过滤介质孔径这种相对过滤又称为深层介质过滤。一、空气过滤除菌的原理

1.布朗扩散作用

2.拦截作用4.重力沉降

3.惯性碰撞5.静电吸引①当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用，除菌效率随气流速度增加而上升②当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用，除菌效率随气流速度增加而降低③当气流速度中等时，拦截起主要作用④当气流速度过大时，已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回气流中，除菌效率下降二、空气过滤除菌的介质

1.纤维状或颗粒状介质①棉花②玻璃纤维③活性炭这类过滤介质对0.3μm以下的颗粒过滤效率仅为99%，难以满足工业发酵的无菌要求，需多次过滤。

缺点：体积大，占用空间大，操作困难，装填介质费时费力且松紧度不易掌握，空气压力降大，介质灭菌和吹干耗用大量的蒸汽和空气。深层棉花、活性炭过滤器的结构

2.过滤纸类介质①超细玻璃纤维纸：这类介质过滤效果较好，对空气的阻力和压力降较小。缺点是强度不够，特别是受潮后强度更差。②石棉滤板：优点是湿强度大，受潮时不易穿孔或折断，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间长。缺点是由于纤维直径大，过滤效率不高，只适用于空气分过滤器。③滤棒：

3.烧结材料类介质

烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等4.新型过滤介质①能除去全部M，但不能除去噬菌体的过滤介质，主要有膜孔小于0.22um的聚偏四氟乙烯（PVDF）和聚四氟乙烯（PTFE）膜材②能除去小至0.01um的微粒，可除去噬菌体，主要有Bio-X滤材和膨化聚四氟乙烯4.3.3空气过滤除菌的流程1、空气的处理：（1）空气的粗滤空调过滤网作用：主要是捕集较大的灰尘颗粒型式：

布袋式过滤器、油浴洗涤过滤器水雾除尘过滤器、填料式过滤器旋风分离式过滤器等要求：过滤效率高，阻力小（阻力大则增加空压机的吸入负荷，降低压缩空气的排出量）将滤布缝制成与骨架相同形状的布袋，绷紧缝于焊接在进风口的骨架上。多用毛质绒布或合成纤维滤布；滤布应定期更换。结构简单，过滤效率高；但过滤阻力大布袋式过滤器油浴洗涤过滤器空气通过油箱中的油层洗涤，空气中的微粒被油黏附而逐渐沉降于油箱底部而被除去。百叶窗式的圆盘可分离大滴油雾，过滤网分离小颗粒油雾。效果好；但耗油多水雾除尘过滤器空气从设备底部进口管吸入，经装置上部喷下的水雾洗涤，空气中的灰尘、微生物微粒被黏附沉降，从器底排出。空气流速1-3m/s，太高则带入水雾太多，降低空压机的排气量。（2）空气的压缩和稳压小型空压机空气贮罐作用：消除空压机排出空气量的脉动维持稳定的压力分离部分油水

过高温度的压缩空气如果直接进入空气过滤器，有可能引起过滤介质的炭化或燃烧；且增大了发酵罐的降温负荷；高温空气还会增加发酵液水分的蒸发，影响微生物的生长。冷却器类型：

立式列管式热交换器沉浸式热交换器喷淋式热交换器（3）压缩空气的冷却（4）压缩空气除油除水作用：分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾气液分离器大气中总含有一定量的水分，并以气态存在。空气中的水蒸气分压与同温度下的饱和蒸汽压之比，称为相对湿度或相对湿含量。1）当空气中的水蒸气过多，超过饱和度（相对湿度100%）时；2）或在空气冷却至露点以下时

空气中的水蒸气才会形成水滴析出夜间空气温度降低时，空气中的水分会有一部分析出，形成露水或霜。这说明在水蒸气含量不变的情况下，由于温度的降低，能够使空气中原来未达饱和的水蒸气可变成饱和蒸气，多余的水分就会析出。使水蒸气达到饱和时的温度就叫作露点。气液分离器型式：丝网分离器旋风分离器旋风分离器原理：利用气流从切线方向进入容器，在容器内形成旋转运动时产生的离心力场来分离重度较大的微粒。优缺点：旋风分离器结构简单，制造方便；对分离10m以上的微粒效率较高，但对10m以下的微粒比较困难。丝网分离器原理：利用填料的惯性拦截优点：由于丝网的表面间隙小，可除去较细小的雾状微粒，分离效率可达98-99%填料：

不锈钢丝，塑料丝

0.1-0.4mm（5）压缩空气的再加热（6）空气总过滤器过滤（7）空气分过滤器过滤二、空气净化的一般流程：

空气吸气口粗过滤器空压机贮罐

冷却器分离器加热器总过滤器

分过滤器无菌空气1.冷热空气直接混合的除菌流程2.高效前置过滤器除菌流程空气吸气口粗过滤器高效前置过滤器

空压机贮罐冷却器分离器加热器总过滤器3.两级冷却、分离、加热的除菌流程