松材线虫和拟松材线虫的生物学特性比较

松材线虫和拟松材线虫的生物学特性比较

在死树中，普通松叶跳蚤和假松叶跳蚤（b）。它们时而混生,时而单独出现。其致病力已被很多学者作了结论,前者是松树致死的主要原因,后者仅有微弱的致病力。通过致病力、生理生化实验数据比较,加之形态学上的差异,和杂交不能产生后代的试验,均证明各是1个不同的种。但近来国外越来越多的学者报道上述2种线虫存在中间类型、美国的上述两种线虫可以杂交成功,法国的松材线虫与日本的松材线虫或拟松材线虫可以杂交成功,认为两者同是1个种,是种内致病性的变异;但也有杂交不成功的报道。作者就上述2种线虫的重要形态、酯酶带数及迁移率、脂肪酸的组分等进行比较,并作杂交试验,探索我国这两种线虫之间的关系。一、纯培养物的试验1989年6月从死亡的黑松分离并得到上述两种线虫的纯培养物供以下试验。单异活体培养所用培养基为PDA,饲料真菌是松梢枯病菌(Sphaeropsissapinea)。(一)交合伞观察下的扫码分别测量两种线虫的尾尖突长度、计算具尾尖突的比例、观察尾部形状和雄虫交合伞形状。在观察雄虫交合伞时,无论使用化学药剂或热力杀死的雄成虫,尾端均呈钩状,欲使其腹部向上观察交合伞几乎不可能。为了从腹面观察交合伞,只能用活材料,以清水作浮载剂制成临时玻片。观察前用吸水纸吸去坡片上的水,直至线虫不能活动,然后轻轻推动盖玻片。由于盖玻片的移动,线虫便象被搓的绳子呈一直条状。在众多的雄虫中寻找腹部向上者,即交合伞展开者。这时的雄虫交合伞清晰可见,便于显微摄影。(二)接种松材线虫及接种2龄线虫在W.R.尼克尔的标准的交配技术基础上作了修正。1989年12月,选用长10cm、内径0.7cm的小指形管,内装3mlPDA培养基。灭菌后,在圆段面上接松梢枯病菌。待菌丝长满段面,接种2龄线虫各1条。共3种处理:(1)每管内接种2条松材线虫,共51管;(2)每管内接种2条拟松材线虫,共45管;(3)每管内接1条松材线虫1条拟松材线虫,共44管。半月后和1月后检查线虫数量。(三)同工酶电泳1.投资研磨法上述两种线虫分别培养在长满松梢枯病菌的PDA平面上,半月后,清水洗下线虫,1500转/min离心5min,弃上清液,得到浓度极大的线虫水悬液。加纯甘油、水浴研磨后,经8000转/min,20min离心。取上清液备用。2.硬橡胶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。凝胶浓度10%,pH8.7。电泳时电压200V,电流5mA,电泳时间1小时55分。3.兰rr-电泳有序电泳法20mg醋酸-β-萘酯,溶于20ml丙酮,加20ml0.1mol、(pH6.7)磷酸缓冲液、再加20mg坚牢兰RR。将电泳后的凝胶放入上述溶液中37℃保温15min即显出酯酶谱带。计算Rf值。(四)脂肪酸组分析1.松材线虫干样两种线虫分别作松梢枯病菌的单异活体人工繁殖。两周后洗下线虫,离心,烘干。得松材线虫干样0.0823g,拟松材线虫干样0.0711g。样品经苛性钾/甲醇皂化。除去不皂化物质后,皂化物经甲酯化处理(BF3/甲醇法),作气相色谱分析。2.测量条件仪器用岛津GC-9A,OV-101玻璃毛细管柱25m,程序升温,N2为载气,进样温度290℃。无分馏进样。3.新型finn空间根据质谱分析仪(GC-MS)。质谱条件:FINNIGAN4021色一质联用仪;电子轰击源(EI),扫描范围35—650,电子能量70eV。二、结果(一)尾尖突-易突比例两种线虫雌成虫的尾部形状、尾尖突的长度和具尾尖突的比例,均与过去的报道一致。松材线虫雄虫交合伞为卵圆形,拟松材线虫的是平截形或称平口铲形,如图1。(二)拟松材线虫的指形管(1)51管接2条松材线虫的指形管,有17管出现大量线虫,比例占33.33%;(2)45管各接2条拟松材线虫的指形管,有12管内有大量线虫,所占比例为26.66%;(3)44管每管接1条松材线虫和1条拟松材线虫,半月后有些可见到1—2条成虫,再经半月则无1管可以见到任何线虫存在。(三)同工酶电泳松材线虫酯酶谱带有3条,迁移率分别为0.42、0.45、0.49;拟松材线虫只有1条段带,迁移率为0.65。见图2。(四)内称化合物催化剂图3中(a)和(b)分别为松材线虫和拟松材线虫的脂肪酸气相色谱测定结果,3次重复均较一致。图中1为十五烷酸,2为十六烷酸(棕榈酸)、3为十七烷酸(内称化合物)、4和5分别为十八烯酸(亚油酸)和十八烯酸(油酸)、6为十八烷酸(硬脂酸)、7为廿烷酸(花生酸)。各成分的含量由内标法计算,结果如表所示。从表1可知,松材线虫与拟松材线虫的脂肪酸种类虽相同,但脂肪酸总量有差异,特别是某些脂肪酸有3倍多的差异,如十五烷酸松材线虫明显比拟松材线虫多;而花生酸又明显比拟松材线虫少近3倍。三、电泳和脂肪酸分析的研究是为2个种的鉴定提供了依据从致病力、形态学、生理学和生物化学试验结果来看,供试的两种重要的松树线虫之间有极明显的差异,表明二者为不同的种;而不应属于同一种之间的不同致病变异。低等动物分种的重要依据是生殖器官的构造,这决定了种间能不能交配成功产生后代。本文从交合伞形状和杂交不成功证实二者应属于不同种。尽管尾部形状,尾尖突大小有中间类型,而交合伞形状应是区分这两种线虫的重要形态特征。酯酶同工酶谱带数和迁移率亦被公认为生物分种的重要手段。这一结果也支持了它们应为2个种的结论。脂肪酸的组分分析用于种的鉴定是一种尝试,结果也表明二者有明显的差异,亦可作为分种的手段。作者在应用W.R.尼克尔的标准交配技术的过程中发现,在一个培养皿内放2条线虫会出现由于范围太大,造成老死都无机会相遇的困难,甚至在1个试管斜面上也会出现这种情况。改进的结果可保证2条线虫在直径0.7cm的圆面积内相遇。选用2龄幼虫可避免用接近成熟幼虫与成虫混淆的可能性,保证了试验的可靠性。试验中用了各自幼虫作对照,每处理都可能出现3种情况:(1)发育后2条都是雄虫;(2)发育后2条都是雌虫;(3)发育后1雌1雄。试验在足够多的重复下,1个试管内放的是同1种线虫的处理均应在1/3的试管内出现1雌1雄,从而产生大量后代线虫。结果在纯松材线虫或纯拟松材线虫的组合中均近1/3的试管内出现大量线虫。如果2种线虫能交配,第三种处理亦应有1/3的试管内出现杂交后代;然而没有1管见到有大量线虫存在。表明此种试验设计结果是可靠的。电泳、脂肪酸分析的样品线虫是在具松梢枯病菌的PDA培养而成。这种真菌在无光、弱光条件下决不产生孢子。因为这两种线虫不取食真菌孢子,且孢子比重与线虫相近,离心亦难除去,会严重影响电泳和脂肪酸分