不同方法学检测耳聋易感基因GJB2的对比研究-Sanger测序法与导流杂交技术的方法学对比

ADDINCNKISM.UserStyle不同方法学检测耳聋易感基因GJB2的对比研究—Sanger测序法与导流杂交技术的方法学对比[摘要]目的：比较Sanger测序与导流杂交技术应用于先天感音神经性耳聋患者常见耳聋易感基因GJB2检测的优缺点，并探讨其临床应用价值。方法：随机抽取120例耳聋收检样本，分别采用Sanger测序与导流杂交技术检测非综合征型耳聋易感基因GJB2的突变情况，对比研究两个方法学的检测结果。结果：Sanger测序法的突变检出率大于导流杂交技术（χ2=4.167，P=0.031）；其灵敏度低于导流杂交技术（χ2=15.54，P=0.001），两者比较均具有统计学意义。Sanger测序法的准确性（100%）高于导流杂交技术（90%）；其耗材、耗时均多于导流杂交技术，且具有更大的通量。结论：在检测中国国情的致聋基因GJB2的突变情况，Sanger测序法具有高特异性、高准确性、高通量的优点，更适合罕见未知突变的基因检测；导流杂交技术的优势在于高灵敏度、操作简易、成本低、耗时少，更适合大规模的临床筛查。2种方法学结合检测临床非综合征型聋病，检测结果更为可靠、准确、科学[关键词]致聋基因GJB2；Sanger测序；导流杂交技术

AcomparativestudyonthedetectionofdeafnesssusceptibilitygeneGJB2bydifferentmethods—MethodologicalcomparisonbetweenSangersequencinganddiversionHybridization[Abstract]Objective:TocomparetheadvantagesanddisadvantagesofSangersequencinganddiversionhybridizationinthedetectionofcommondeafnesssusceptibilitygenes(GJB2)inpatientswithcongenitalsensorineuralhearinglossandtoexploreitsclinicalvalue.Methods:Sangersequencinganddiversionhybridizationwereusedtodetectthemutationofnon-syndromicinheriteddeafnesssusceptibilitygene(GJB2)in120casesofdeafness.Theresultsoftwomethodswerecompared.Results:ThemutationrateofSangersequencingwashigherthanthatofdiversionhybridization(χ2=4.167,P=0.031).Itssensitivitywaslowerthanthatofdiversionhybridization(χ2=15.54,P=0.001).TheaccuracyofSangersequencing(100%)washigherthanthatofdiversionhybridization(90%).Theconsumptiontimeismuchlongerthanthatofdiversionhybridization,andithasmoreflux.Conclusion:InthedetectionofdeafnessgeneGJB2mutationinChina,Sangersequencinghastheadvantagesofhighspecificity,highaccuracyandhighthroughput,soitismoresuitableforrareunknownmutationgenedetection.Theadvantagesofdiversionhybridizationarehighsensitivity,simpleoperation,lowcost,lesstimeconsumingandmoresuitableforlarge-scaleclinicalscreening.Thetwomethodscombinedwiththedetectionofclinicalnon-syndromicdeafnessaremorereliable,accurateandscientific.[Keywords]deafnessgeneGJB2;Sangersequencing;diversionhybridizationtechnique

目录引言 11研究资料 21.1研究对象 21.2样本类型 21.3DNA提取和保存 21.4主要的仪器、试剂及软件 32研究方法 52.1PCR扩增 62.2Sanger测序检测 82.3导流杂交技术 132.4结果判读 152.5统计学分析 163结果分析 173.1应用Sanger测序检测GJB2的结果 173.2应用导流杂交技术检测GJB2的结果 173.3两种方法学的结果对比 183.4两种方法学耗时、耗材以及通量的比较 244讨论 25结论 27参考文献 28致谢 31引言耳聋是由感音神经功能紊乱所导致的疾病[1]，约60%新生聋儿是遗传因素所致[2,3]。据遗传特征推测，耳聋具有4种分型，分别为：1%性连锁（DFNX-linked,DFNY-linked），约4%线粒体遗传，15%常染色体显性遗传（DFNA），以及高达80%的常染色体隐性遗传（DFNB）[4]。其中，占75%～80%常染色体隐性遗传的非综合征耳聋（NSHL）患者中，约有50%是由易感基因GJB2突变所致[5,6]。GJB2被视为最常见的耳聋致病基因[7]，其全称为缝隙连接蛋白2（Gapjunctionprotein2），是第一个被发现导致常染色体隐性遗传性耳聋的基因[8,9]。据分子流行病学调查研究显示，GJB2突变位点存在明显的种族差异性：西方国家（欧洲、北美和中东等地）以35delG最为常见，犹太则为167delT，日本为235delC，而中国以235delC纯合突变最常见，其突变检出率高达13.64%～21.5%[10,11,12]，即每100人中至少有13～21人具有可致遗传性耳聋的基因缺陷。据研究发现，235delC纯合突变患者多数会出现重度或极重度听力损失，且多为双耳感音神经性聋[13]。目前，耳聋已严重影响了人们的身心健康和家庭生活，大大增加了国家医疗支出，降低了我国人口素质。在此背景下，实现耳聋的预防与干预应刻不容缓：一级防控（婚前、孕前检测）可降低后代耳聋发病率；二级防控（产前诊断）可减少耳聋出生缺陷；三级防控（新生儿筛查诊断）可实现早发现、早干预、早治疗[14]。自上世纪70年代，Sanger与Coulson首次发表了有关双脱氧链终止法测序技术的相关学术论文，即Sanger测序的论文，人类对基因检测技术的研究便日趋深入，逐渐推动测序技术的飞速发展，同时也促进了新的耳聋易感基因检测技术的形成与建立[15]。目前，应用于耳聋易感基因检测的生物遗传分子学检测技术主要有：基于分子杂交的基因芯片、点杂交；基于核酸序列检测的Sanger测序、二代测序；以及定量PCR技术、变性高效液相色谱分析、高分辨率熔解曲线分析等[16,17,18,19]。20世纪末至21世纪初，随着Sanger测序广泛应用于耳聋易感致病基因的检测，解放军总医院耳鼻喉科分子诊断中心相继制定和建立了耳聋易感基因检测以及产前诊断的策略与平台，指导耳聋易感基因的诊断与治疗，为降低耳聋出生率、提高全民听力水平做出了巨大的贡献[20,21]。鉴于Sanger测序的技术成熟和其在核酸测序的应用广泛，以及凯普生物公司自主创新的综合PCR和低密度基因芯片的导流杂交技术在检测HPV分型的高灵敏度临床筛查意义[22,23]。本研究课题，将利用随机抽取的凯普生物公司耳聋易感基因收检样本120例，分别应用PCR基因芯片的导流杂交技术与DNA测序“金标准”的Sanger测序技术进行对比研究，通过对比Sanger测序的核酸序列检测结果与导流杂交技术的探针结合结果，比较两种方法学在检出率、准确性、灵敏度的差异[24,25]，验证哪一种方法学更符合中国国情的耳聋临床检测，明确哪一种耳聋基因检测诊断技术更为全面﹑准确﹑高效，从而为临床诊断提供安全﹑有效﹑科学的参考依据。1研究资料1.1研究对象通过收集凯普生物公司2018年收检的所有检测耳聋易感基因样本资料，随机抽取100个未知样本（包括EDTA-全血样本和DNA样本）和20个阳性结果的DNA样本。其中，未成年样本22例（包括新生儿和婴幼儿），占18.33%，成年人样本98例，占81.67%。1.1.1纳入标准GJB2基因突变所致的感音神经性耳聋；疑似先天感音性耳聋。1.1.2排除标准前庭导水管扩大或存在其他内耳畸形；综合征型耳聋；智力障碍、颅脑外伤导致的耳聋；C1494T或A1555G突变（母系遗传的相关突变类型）。1.2样本类型EDTA-全血样本（静脉外周血，成年人）：需要进一步DNA提取操作才可使用；血斑卡样本（足跟血，婴幼儿）：也需要进一步提取才可检测；现成DNA样本：由医院以及其他机构提取。1.3DNA提取和保存1.3.1DNA的提取EDTA-全血样本的处理：取已加入抗凝剂EDTA(乙二胺四乙酸）的血液样本200ul，采用潮州凯普公司的离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒，进行手动提取血液白细胞中的DNA基因组[26]；加入20ul蛋白酶K，降解血液中的蛋白，再加200ul裂解液（溶液L），震荡离心，于56℃下温浴18min，期间颠倒混匀4次；加入200ul无水乙醇沉淀DNA，再加500ul杂质洗脱液（溶液W1和溶液W2）洗脱核蛋白、糖类和RNA等杂质3次（溶液W1洗脱1次，溶液W2洗脱2次）；加入提前预热至56℃TE洗脱液60ul，将DNA从离心柱上洗脱下来，置于新的1.5mlEP管。取2ulDNA，采用百泰克公司的超微量紫外可见分光光度计检测DNA的溶度（ng/ul）和纯度（A260/A280，其范围在1.6-2.0）。血斑卡DNA提取的后半部分与EDTA-全血样本提取一致，前三步操作为：用酒精灯消毒（避免交叉污染）后的剪刀沿着边缘剪下一孔血斑卡，剪碎，置于1.5ml的EP管，加入溶液T（细胞裂解液）300ul(加入量可稍作调整，以保证没过血斑卡碎纸），再加蛋白酶K20ul，充分震荡混匀；将EP管于56℃下温浴20min，期间颠倒混匀4-5次；再加溶液L200ul，震荡混匀，于70℃下温浴15min；加入预冷的无水乙醇200ul，后续操作与EDTA-全血样本的提取操作一致。1.3.2DNA的保存DNA样本需保存在-20℃环境中，且不得超过3个月，反复冻融次数不得超过6次，否则DNA会发生降解。1.4主要的仪器、试剂及软件1.4.1主要的仪器设备实验中主要的仪器设备，见表1.1。表1.1实验的仪器设备仪器名称型号出厂商3500xl基因分析仪3500XL,DX美国ABI公司医用核酸分子杂交仪HB-2012A广东凯普生物科技股份有限公司PCR扩增仪ProFlexTM3X32-Well美国ABI公司全自动凝胶成像分析系统GELDOCXRFBIO-RAD集团双稳定时电泳仪电源DYY-6C北京市六一仪器厂琼脂糖水平电泳仪DYCP-31DN北京六一仪器厂超微量紫外可见分光光度计ND5000百泰克生物技术有限公司核酸检测仪ND-2000C(C)广东省农垦集团进出口有限公司台式高速冷冻离心机5810R德国EPPendorf（艾本德）公司干式恒温器MK-2000-2E奥盛集团漩涡混合器V3S025德国IKA公司微型离心机MINI-6K珠海黑马医学仪器有限公司微孔板离心机MINI2596珠海黑马医学仪器有限公司离心机5418德国EPPendorf公司电子天平ME2002梅特勒-托利多生物安全柜BSC-110ⅡA2-X济南鑫贝两生物技术有限公司微量移液枪吉尔森/百得微波炉P70020P-N9(WO)格兰仕（注：微量移液枪的规格有：2ul、2.5ul、10ul、20ul、100ul、200ul以及1000ul。）1.4.2主要的试剂潮州凯普生物公司的血液基因组DNA提取试剂盒、广州凯普公司的耳聋易感基因检测试剂盒—PCR试剂（PCR+导流杂交法）、广州凯普公司的耳聋易感基因检测试剂盒—杂交试剂（PCR+导流杂交法）、生工公司的耳聋易感基因检测引物、ABI公司的普通PCR试剂盒、ABI公司的BigDyeTerminator测序PCR试剂盒；琼脂糖粉、宝日医公司的LD1000DNAMarker、TAKARA公司的10×LoadingBuffer、赛百威的GoldView染料、1×TAE缓冲液；ABI公司的磁珠、无水乙醇、125mMEDTA(PH=8.0)、3MNaAc(PH=5.2)、Hi-Di甲酰胺。1.4.3主要的软件Chromas软件：分析测序结果3500Series2软件：3500xl基因测序仪配套软件SeqA6软件：实现测序结果中峰图与序列的相互转化APE_win_current软件：用于基因编辑，实现两序列比对BioEdit软件：分析核苷酸序列，蛋白质序列等ImageLad软件：全自动凝胶成像分析系统配套软件CNKIE-Study软件：阅读CAJ、Pdf格式文献资料SPSSStatistics软件：分析实验数据的相关性Excel：记录、汇总实验数据2研究方法对随机抽取100个未知样本和20个阳性结果的DNA样本分别进行Sanger测序和导流杂交，对比两种方法学的阳性检出率，并从阳性样本中分别抽取2例235delC突变样本、1例299delAT突变样本、1例176del16突变样本，均稀释成为1ng/ul﹑2ng/ul﹑3ng/ul﹑5ng/ul﹑10ng/ul﹑15ng/ul和20ng/ul等浓度。在相同的实验条件下，分别用这两种方法进行检测，分别从准确率、灵敏度进行两种方法学的对比。并用Excel表格记录所有的检测结果，联合SPSSStatistics17.0软件，对实验结果进行分类、归纳、分析和统计。具体的研究实验如下：2.1PCR扩增原理：与DNA的天然复制过程相似，遵循碱基互补配对原则，并以与目的序列互补的单链核苷酸为引物，进行特异性扩增。目的：扩增DNA目的片段。2.1.1测序普通PCR取2.5ulDNA，加入ABI公司的PCR扩增试剂，用PCR扩增仪对目的DNA片段进行扩增。扩增体系、检测位点：分别见表2.1、表2.2；扩增反应过程：见图2.1。表2.1GJB2基因PCR扩增的反应体系（25.00ul）试剂加样量（ul）备注模板DNA2.5目的DNA基因组片段10×PCRBuffer2.5提供稳定的反应环境25mMMgCl23.6润滑剂，Taq酶激活剂25mMdNTPs0.3核苷酸原料：dATPs﹑dTTPs﹑dGTPs﹑dCTPsGJB2-FPrimers1.5正向引物GJB2-RPrimers1.5反向引物RocheTaq酶0.75DNA聚合酶，催化DNA合成ddH2O12.35去离子水合计25.00表2.2ABI公司的测序普通PCR试剂盒检测GJB2的位点主要包括：检测位点突变类型突变点简称GJB2-235delC235MGJB2-299delAT299MGJB2-176delGCTGCAAGAACGTGTG176MGJB2-155delTCTGGJB2-35delG35M图2.1GJB2基因PCR扩增的反应过程2.1.2杂交PCR取两份相同DNA各2ul，加入凯普公司的PCR扩增试剂盒，用PCR扩增仪对目的DNA片段进行扩增。扩增体系、检测位点：见表2.3、表2.4；扩增反应过程：见图2.2。表2.3GJB2基因导流杂交PCR扩增反应体系（30.0ul)试剂加入量（ul）备注A管A组PCR混合液27.5合计：30.04对引物（0.2ul），1×Buffer，3.0mMMgCl2，0.4mMdNTPsDNA聚合酶0.5催化DNA扩增合成模板DNA2.0目的扩增基因组片段B管B组PCR混合液27.5合计：30.04对引物（0.1ul），1×Buffer，3.0mMMgCl2，0.4mMdNTPsDNA聚合酶0.5催化DNA扩增合成模板DNA2.0目的扩增基因组片段表2.4凯普公司的杂交PCR试剂盒检测GJB2的位点包括：检测位点突变类型突变点简称GJB2-235delC235MGJB2-299delAT299MGJB2-176delGCTGCAAGAACGTGTG176MGJB2-35delG35MGJB2-155delTCTG图2.2GJB2基因导流杂交PCR扩增反应过程2.2Sanger测序检测2.2.12%琼脂凝胶回收：原理：带负电的磷酸根残基均存在于DNA的双螺旋骨架两侧，在通电情况下，能使不同长度的DNA片段在包含电解质的多孔介质凝胶上进行不同的迁移，从而形成不同距离的DNA条带。目的：分离DNA片段，鉴定PCR扩增效果。实验：根据样本量的多少配置相应大小的凝胶，具体反应体系：见表2.5。表2.5不同样本量所对应的不同加样量的琼脂糖凝胶反应体系琼脂糖粉加入量（g）1×TAE缓冲液加入量（ml）GoldView染料加入量（ul）微波炉加热时间（min）1-11人份0.40020.01.0112-24人份0.80040.02.0225-100人份1.60080.04.02具体实验操作：根据样本量，称取适量的琼脂糖粉于500ml的锥形瓶，量取适量的1×TAE缓冲液加入瓶中，套上锡箔纸瓶盖，微波炉加热适当时间；加入适量的GoldView染料，转移至胶板上，自然冷却1h（或者放4℃冰箱30min），拔去梳子，并检查胶孔的完整性；将配置完成的2%琼脂凝胶置于琼脂糖水平电泳仪，在第一个胶孔加入4ul的LD1000DNAMarker（分子量参照物）；取PCR扩增完成的样本4ul，加入1ul的10×LoadingBuffer（示踪染料），混合均匀后，取4ul加入到第二个胶孔，依次操作，将所有的样本加入胶孔，并记录点样的编号和位置；插上电极，打开双稳定时电泳仪电源，在150V，电泳20min；电泳跑胶完毕，关闭电源，取出凝胶，使用全自动凝胶成像分析系统进行成像拍照，编辑条带信息（一般地，跑出来的条带数量与加入的引物对数成正相关，测序普通PCR一般只有一对引物，故只有一个条带，示例：见图2.3）。图2.3GJB2基因PCR扩增产物的电泳成像2.2.2磁珠回收原理：一定浓度的聚乙二醇（PEG）和盐离子，可使DNA吸附到含有羧基的高分子磁珠表面。此过程是可逆的，即DNA可被洗脱下来。目的：去除非特异性PCR扩增产物和引物二聚体。具体实验操作：将PCR扩增产物震荡均匀，离心，加入50ul磁珠，震荡混匀，转移至新的1.5mlEP管；静置5min后，转移至磁力架上，静置3min，去除上清液（吸液时注意枪头要置于远离磁珠一侧，切勿吸到磁珠，否则要打出清液，在磁力架上重新静置）；再加入70%酒精（现配现用）200ul，振荡混匀后，瞬离，静置5min，放置于磁力架上静置3min，去除上清液；再次酒精洗涤（注意：此时应彻底去除上清液，确保无成流或成滴的酒精残留）；开盖晾干约15min（注意：不低于10min，确保无酒精残留，排除后期测序跑胶酒精峰对实验结果的影响）；加入57ul去离子纯化水，振荡混匀，瞬离，静置5min，放置于磁力架上静置5min，吸取50ul上清液于新的1.5mlEP管中。2.2.3测序PCR原理：在DNA聚合酶的催化和双脱氧核苷酸（ddNTP)的终止扩增作用下，发生大量的随机终止扩增反应，产生一系列长度只相差一个碱基的DNA片段。目的：根据不同长度的DNA片段的电泳速度不同，上测序仪电泳，就能检测出整段DNA的序列。具体实验操作：测序PCR前，必须先用核酸检测仪测定磁珠回收产物的浓度，确保满足测序PCR的DNA加入量（根据PCR产物的长度在200-500bP，为保证后期上机测序结果清晰准确，要求加入DNA模板量在10ng左右，故DNA的浓度最好在10ng/ul，若是大于该浓度，应先用去离子纯化水进行稀释）各取1.0ulDNA（当DNA的浓度不满足测序PCR的要求时，其加入量可根据实际浓度做适当调整），加入ABI公司的测序PCR试剂盒，用PCR扩增仪对目的DNA片段进行扩增。扩增体系1/8X：分别见表2.6；扩增反应程序：见图2.4。表2.6GJB2基因测序PCR的反应体系1/8X（10.00ul）试剂名称加入量（ul）备注上游（正向）端测序反应F5×SeqBuffer缓冲液1.75合计：10.00当TemplateDNA≥9.0ng/ul时，TemplateDNA与ddH20的加入量是一定的；当TemplateDNA<9.0ng/ul时，TemplateDNA的加入量可适当增加（确保加入量在10ng左右），而ddH20的加入量应相应地减少，维持整个体系在10ul。BigDye染料0.5GJB2F-Primer3.2µM1.0TemplateDNA1.0ddH205.75下游（反向）端测序反应R5×SeqBuffer缓冲液1.75合计：10.00BigDye染料0.5GJB2R-Primer3.2µM1.0TemplateDNA1.0ddH205.75图2.4GJB2基因测序PCR的反应程序2.2.4酒精/EDTA/NaAc法纯化产物原理：DNA的多聚阴离子能与很多1价、2价的离子结合成盐，在有机溶剂中即不溶解也不变性，且在-4℃下能形成沉淀。目的：主要去除残留的BigDig染料和多余的荧光标记ddNTPs。采用ABI公司的纯化试剂进行酒精纯化。其反应体系：见表2.7。表2.7GJB2测序PCR产物的酒精纯化反应体系试剂名称加入量（ul）备注125mMEDTA(PH=8.0)1:1混匀，2缓冲液3MNaAc(PH=5.2)加速DNA沉淀无水乙醇30洗脱杂质70%乙醇35需现配现用，洗脱两次高浓度Hi-Di甲酰胺10可保存DNA单链状态1周，但最好在24h内上机测序具体实验操作：开启台式高速冷冻离心机电源，设置温度为4℃进行机内环境预冷；将测序PCR产物转移到96孔板，并记录好样本的编号和位置；取125mMEDTA(PH=8.0)和3MNaAc(PH=5.2)1：1混合后2ul，加入每个样本孔孔底；往样本孔内加入无水酒精30ul，用封孔膜封严，充分振荡混匀后，冰箱-20℃放置5min；将96孔板转移至台式高速冷冻离心机，在转速为3000r、温度为4℃下冷冻离心15min后，取出96孔板倒置，瞬离（转速1300r左右），甩干管中的液体；往每个样本孔内加入70%酒精（现配现用）35ul，在3000r、4℃下，冷冻离心5min，同样地，马上倒置96孔板，瞬离，甩干管中的液体；再用70%酒精重复洗涤1次，在相同条件下，冷冻离心5min，瞬离，甩干管中的液体（转速可达1500r）；开盖让残余的酒精自然挥干，约15min。往每个样本孔加入Hi-Di甲酰胺10ul，吹打混匀，使DNA与Hi-Di甲酰胺试剂充分混匀，以维持DNA单链状态。2.2.5上机测序原理：测序PCR中掺入一定比例的ddNTPs(不同ddNTP带着不同发光基团），产生的一系列相差一个碱基的单链DNA片段，通过电泳收集荧光信号，确定末端的ddNTP，综合所有末端荧光信号，即可检测到整段DNA的碱基序列。具体实验：将加入Hi-Di甲酰胺试剂的96孔板放入3500xl基因分析仪的内槽，在FastSequency程序下进行核酸双向测序，一般地，一个注射可以实现12个样本的双向检测，用时为1h15min，最多可同时测序4个注射，即48个样本（双向）。测序的整个过程和结果可在3500Series2软件上查看，峰图结果可在SeqA6软件上转化为核酸序列，结果分析可在Chromas软件或者BioEdit软件进行，基因编辑、对比分析可在APE_win_current软件上实现。2.3导流杂交技术原理：利用含有生物素标记的引物扩增目的DNA片段，将产物变性成单链后，与尼龙膜条上的特异基因探针进行导流杂交，并通过化学显色来判读结果。2.3.1实验前准备将杂交液、洗脱液（WB1）预热至45℃；将其他试剂平衡至25℃。2.3.2杂交实验具体实验操作见图2.5开启杂交仪电源，设置温度为45℃进行升温开启杂交仪电源，设置温度为45℃进行升温用蒸馏水清洗反应室，开泵，依次放置金属多孔板、塑料薄膜、杂交探针膜条（湿润且无气泡）、硅胶封圈和分隔室；固定压扣盖，升起反应室，泵走残留液体后，关泵用蒸馏水清洗反应室，开泵，依次放置金属多孔板、塑料薄膜、杂交探针膜条（湿润且无气泡）、硅胶封圈和分隔室；固定压扣盖，升起反应室，泵走残留液体后，关泵PCR产物(A、B组)于95℃变性7min，、冰水浴2min（使DNA处于单链状态）PCR产物(A、B组)于95℃变性7min，、冰水浴2min（使DNA处于单链状态）往杂交孔内加杂交液800ul，温育2min后，开泵排液，关泵往杂交孔内加杂交液800ul，温育2min后，开泵排液，关泵在45℃下，加杂交液800ul，把变性后的PCR产物(A、B组)混匀，加入相应反应槽，温育20min后，开泵排液，关泵在45℃下，加杂交液800ul，把变性后的PCR产物(A、B组)混匀，加入相应反应槽，温育20min后，开泵排液，关泵用洗脱液(WB1)冲洗膜4次，每次800ul，间隔5sec，排液完毕后关泵用洗脱液(WB1)冲洗膜4次，每次800ul，间隔5sec，排液完毕后关泵设定温度为25℃进行降温设定温度为25℃进行降温加500ul封阻液，立即开泵排液，关泵，再加500ul封阻液，封膜5min后，开泵排液，关泵加500ul封阻液，立即开泵排液，关泵，再加500ul封阻液，封膜5min后，开泵排液，关泵在25℃下，加500ul酶标液，酶标5min后，开泵排液，关泵在25℃下，加500ul酶标液，酶标5min后，开泵排液，关泵设定温度为36℃进行升温；用溶液A彻底洗膜4次，每次800ul，间隔5sec设定温度为36℃进行升温；用溶液A彻底洗膜4次，每次800ul，间隔5sec在36℃下，加500ul显色液(NBT/BC|P)，避光显色3min后，开泵排液，关泵在36℃下，加500ul显色液(NBT/BC|P)，避光显色3min后，开泵排液，关泵用杂交液洗膜3次，每次800ul，开泵，再用蒸馏水漂洗后，关泵用杂交液洗膜3次，每次800ul，开泵，再用蒸馏水漂洗后，关泵降下反应室，打开压扣盖，取出分隔室和硅胶封圈，取出杂交膜，并用吸水纸上吸干，在1h内观察结果降下反应室，打开压扣盖，取出分隔室和硅胶封圈，取出杂交膜，并用吸水纸上吸干，在1h内观察结果图2.5导流杂交实验过程2.4结果判读2.4.1Sanger测序结果判读在高质量清晰的测序峰图条件下，进行结果判读和分析：一般地，野生型为高质量单峰（但纯合突变也为单峰，故判读基因是否突变还需结合正常序列进行比对确认），而套峰或者双峰，出现碱基序列的缺失或错义，则为突变型[32]。示例：见图2.6﹑图2.7。图2.6GJB2野生型图2.7GJB2突变型2.4.2导流杂交结果判读膜条上基因探针的排列顺序：见表2.8表2.8膜条上基因探针排位Biotin35N155N176N235N299N35M155M176M235M299M1494N1555N7445N538NIVS-N2168N1494M1555M7445M538MIVS-M2168M1229N1229M12201N12201M结果判读：观察膜条上出现的蓝紫色斑点：（注：带字母“N”的代表正常位点，带字母“M”的代表突变位点）空白对照：仅在生物素点（Biotin处）出现斑点；野生型样本：在生物素点及所有正常探针处出现斑点；阳性样本：若正常探针及对应的突变探针位点都出现斑点，则该位点为杂合突变；若突变探针处岀现斑点，而对应的正常探针位点没有岀现斑点，则该位点为纯合突变。示例：见图2.8、图2.9、图2.10、图2.11。图2.8空白对照图2.9野生型样本图2.10176M突变杂合子图2.11235M突变纯合子2.5统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析，两种方法学的对比通常为组间比较资料，可用χ2检验。对于样本量比较多（大于等于40）者，检出率比较可用配对四格表资料的χ2检验；灵敏度比较可用R×C列联表资料的χ2检验。若P值<0.05，则两者为有显著差异，具有统计学意义。对于样本量比较少（小于40），且进行了重复性实验的准确性对比研究实验的计数对比资料，则可用例数百分比来描述[27,28]。3结果分析3.1应用Sanger测序检测GJB2的结果随机抽取的100例耳聋送检样本中，除去检测失败2例，共检出98例。致病突变检出19例，等位基因检出45例，其中235delC的等位基因频率为最高，占21.43%（42/196）,其余60例均未检测到GJB2的任何突变。详情见表3.1。表3.1Sanger测序的检测结果突变类型例数所占比例复合杂合突变（7.14%）c.176-191del16及c.235delC双杂合突变22.04%c.235delC及c.299delAT杂合突变55.10%纯合突变（12.24%）c.235delC纯合突变1111.22%c.299delAT纯合突变11.02%单杂合突变（19.39%）c.235delC杂合突变1313.27%c.299delAT杂合突变11.02%c.176-191del16杂合突变11.02%c.109G>A(P.Val37lle)杂合突变22.04%3.2应用导流杂交技术检测GJB2的结果随机抽取的100例耳聋送检样本中，除去检测失败5例，共检出95例。致病突变检测出19例，等位基因检测出39例，其中235M的等位基因频率为最高，占20.00%（38/190），其余63例均未检测到GJB2的任何突变。详情见表3.2。表3.2导流杂交技术的检测结果突变类型例数所占比例复合杂合突变（7.37%）176M杂合突变及235M杂合突变22.11%235M杂合突变及299M杂合突变55.23%纯合突变（12.63%）235M纯合子1111.58%299M纯合子11.05%单杂合突变（13.68%）235M杂合子99.47%299M杂合子11.05%176M杂合子11.05%3.3两种方法学的结果对比3.3.1GJB2基因突变检出率的对比Sanger测序与导流杂交检测GJB2突变率的比较Sanger测序成功检测样本98例，其中38例为易感基因GJB2突变，突变检出率为38.78%；导流杂交技术成功检测95例，其中32例检出为易感基因GJB2突变，突变检出率为33.68%。Sanger测序检出为阳性的38例样本中，235delC突变31例（31.63%），其中24例（24.49%）为单纯235delC突变，检出率最高；299delAT突变9例，其中4例为单纯299delAT突变；176-191del16突变3例，其中1例为单纯176-191del16突变；以及109G>A(P.Val37lle)突变2例（2.04%），检出率最低，见表3.3、图3.1。导流杂交技术检出为阳性的32例样本中，235delC突变27例（28.42%），其中20例（21.05%）为单纯235delC突变，检出率最高；299delAT突变9例，其中4例为单纯299delAT突变；176-191del16突变3例（3.16%），其中1例（1.05%）为单纯176-191del16突变，检出率最低，见表3.3、图3.2。Sanger测序检出率大于导流杂交技术，P值为0.031，具有统计学意义（P<0.05）,见表3.4。表3.32种方法学检测GJB2基因突变检出数（检出率）的比较突变类型Sanger测序导流杂交技术复合杂合单纯突变复合杂合单纯突变235delC突变7（7.14%）24（24.49%）7（7.37%）20（21.05%）299delAT突变5（5.10%）4（4.08%）5（5.26%）4（4.21%）176-191del16突变2（2.04%）1（1.02%）2（2.11%）1（1.05%）109G>A(P.Val37lle)02（2.04%）00图3.1Sanger测序法检测GJB2基因突变的结果图3.1Sanger测序法检测GJB2基因突变的结果图3.2导流杂交技术检测GJB2基因突变的结果表3.42种方法学检测GJB2基因突变结果的比较Sanger测序导流杂交技术合计χ2值P值突变型野生型突变型326384.1670.031野生型06060合计326698（注：χ2值的计算：当b+c>=40，v=1时，χ2=(b-c)2/(b+c)；当b+c<40，v=1时,χ2=(|b-c|-1)2/(b+c)。）致病检出率﹑等位基因检出率的比较由Sanger测序和导流杂交技术的检测结果可看出：Sanger测序检测GJB2的等位基因检出率高于导流杂交技术；导流杂交技术检测GJB2的致病检出率高于Sanger测序。详情见表3.5，表3.6。表3.5两种方法学对GJB2致病基因的检出数对比致病基因型Sanger测序导流杂交技术235delC/235delC1111235delC/299delAT55235delC/176-191del1622299delAT/299delAT11总计19（19.39%=19/98）19（20.00%=19/95）表3.6两种方法学对GJB2等位基因的检出数对比突变位点Sanger测序导流杂交技术235delC4238299delAT1010176-191del1633109G>A(P.Val37lle)20总计57（29.08%=57/196）51（26.84%=51/190）3.3.2检测GJB2基因突变的准确性对比随机抽取的20例阳性样本，分别采用同一批检测试剂盒，同一批检测仪器，同一实验环境下，同时进行3组平行试验，3组检测结果均一致，重复性结果满足两个独立检测结果之差在95%的概率水平以内。抽检的样本中，11例为235杂合突变，2例235纯合突变，5例299杂合突变，2例176杂合突变。应用Sanger测序检测出结果与已知结果相同（准确率为100.00%），其中，2例检测底峰较高，但不影响结果判读。应用导流杂交技术检测出的结果，其中，2例无法识别判读；2例点浅，但可识别，准确率为90.00%（18/20）,明显较低，详情见表3.7。表3.7两种方法学检测GJB2阳性样本的结果比较编号浓度（ng/ul）样本纯度（A260/A280）对照结果杂交结果测序结果123.001.70299杂合突变299M杂合299delAT杂合突变233.001.82235杂合突变235M杂合235delC杂合突变338.001.80235杂合突变235M杂合235delC杂合突变434.001.79176杂合突变176M杂合176-191del16杂合突变516.001.60235杂合突变235M杂合，突变点浅235delC杂合突变619.001.72176杂合突变176M杂合176-191del16杂合突变749.001.78299杂合突变299M杂合299delAT杂合突变812.001.59235杂合突变多个正常位点点浅，识别不出异常位点235delC杂合突变，底峰较高952.001.74235杂合突变235M杂合235delC杂合突变1038.001.80235杂合突变235M杂合235delC杂合突变1144.001.76299杂合突变299M杂合299delAT杂合突变续表3.7编号浓度（ng/ul）样本纯度（A260/A280）对照结果杂交结果测序结果1242.001.75299杂合突变299M杂合299delAT杂合突变1333.001.83235杂合突变235M杂合235delC杂合突变1414.001.60235杂合突变235M杂合,突变点浅235delC杂合突变1524.001.84235杂合突变235M杂合235delC杂合突变1639.001.74235纯合突变235M纯合235delC纯合突变1752.001.72299杂合突变299M杂合299delAT杂合突变1810.001.58235杂合突变多个正常位点点浅，识别不出异常位点235delC杂合突变，底峰较高1947.001.69235杂合突变235M杂合235delC杂合突变2045.001.75235纯合突变235M纯合235delC纯合突变3.3.3检测GJB2基因突变的灵敏度对比从阳性样本中抽取DNA浓度和纯度相对适合的235delC突变样本2例、176del16突变样本1例、299delAT突变样本1例，分别稀释为1ng/ul﹑2ng/ul﹑3ng/ul﹑5ng/ul﹑10ng/ul﹑15ng/ul和20ng/ul等浓度。浓度为15ng/ul和20ng/ul，两种方法学均能清晰检测出结果；浓度为10ng/ul，两者基本能检测出结果，其中，1例应用Sanger测序检测出底峰偏高，但能识别判读；浓度为5ng/ul，Sanger测序均出现底峰偏高，导流杂交技术除了1例点浅，其余均能清晰识别；浓度为1ng/ul和2ng/ul，导流杂交技术均能进行结果判读，Sanger测序则全是乱峰﹑套峰，完全无法判读，详见表3.8。Sanger测序检测GJB2基因突变的可识别率为57.14%（18/28），导流杂交技术为100%（28/28），总可识别率为78.57%（44/56）。可见，导流杂交技术的灵敏度远高于Sanger测序。通过R×C列联表资料进行χ2检验，χ2值为15.54，P值为0.001（远小于0.05），该统计学比较分析具有统计学意义，见表3.9。表3.82种方法学检测GJB2基因突变的灵敏度比较样本编号浓度（ng/ul)纯度（A260/A280)检测判读识别程度备注Sanger测序导流杂交技术21.001.80－＋235delC杂合突变2.001.80－＋3.001.80－＋＋5.001.79＋＋＋10.001.80＋＋＋＋＋15.001.80＋＋＋＋＋＋20.001.80＋＋＋＋＋＋41.001.79－＋176-191del16杂合突变2.001.79－＋3.001.80－＋＋5.001.79＋＋＋10.001.79＋＋＋＋＋15.001.79＋＋＋＋＋＋20.001.79＋＋＋＋＋＋71.001.78－＋299delAT杂合突变2.001.78－＋3.001.79－＋＋5.001.78＋＋＋10.001.78＋＋＋＋15.001.79＋＋＋＋＋＋20.001.78＋＋＋＋＋＋201.001.75－＋235delC纯合突变2.001.74－＋3.001.75－＋5.001.75＋＋＋10.001.75＋＋＋＋＋15.001.74＋＋＋＋＋＋20.001.75＋＋＋＋＋＋（注：检测可判读识别程度可用“+”/“-”表示。其中，“+++”表示检测结果很清晰，易判读；“++”则表示清晰可识别，能判读；“+”表示可识别，勉强能判读；而“—”表示不可识别，难以判读。）表3.92种方法学检测GJB2基因突变的可识别判读程度组别例数易识别可识别勉强可识别不可识别χ2值P值Sanger测序288351215.540.001导流杂交技术2812790合计5620101412（注：χ2值的计算：χ2=56×[82/（28×20）+32/（28×10）+…+92/（28×14）+0－1]=15.54自由度的计算：v=（2-1）×（4-1）=3。）3.4两种方法学耗时、耗材以及通量的比较以14个耳聋易感基因GJB2样本量为例，DNA提取需1.5-2h，消耗凯普公司的离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒一组，1.5mlEP管28个，2.0ml带滤芯EP管14个。Sanger测序法检测GJB2基因突变需检测双端（正向和反向），均要经历“普通PCR－凝胶电泳－磁珠回收－测序PCR－酒精纯化－上机测序”多个步骤，总耗时为15h，通量为96，还需消耗112个EP管，1个96孔板，封孔膜若干，以及实验室里其他常见耗材（如，吸水纸、枪头等）；导流杂交技术也要进行双管检测，但只需经过“PCR扩增－凝胶电泳－变性杂交”三个环节，总耗时为6h，通量为14（除去空白对照），还需消耗PCR扩增中用到的28个EP管，以及少量的实验室常见耗材。在试剂消耗方面，Sanger测序法除了PCR扩增试剂盒﹑BigDyeTerminator测序PCR试剂盒、凝胶电泳试剂的消耗，还需要大量的纯化试剂，包括无水乙醇﹑70%乙醇﹑磁珠﹑125mMEDTA﹑3MNaAc；以及大量去离子纯化水﹑高纯度Hi-Di甲酰胺试剂和3500XL测序仪上电极缓冲液；相比之下，导流杂交技术耗材少了许多，只需要消耗PCR扩增试剂盒﹑杂交试剂盒以及凝胶电泳试剂。总体上，Sanger测序法检测GJB2基因突变耗时比导流杂交技术长﹑耗材比导流杂交技术多﹑通量比导流杂交技术大。4讨论全国性聋病分子流行病学的调查研究表明，中国人群的常见耳聋致病基因的携带率非常高，是导致中国耳聋高发的主要原因。GJB2、SLC26C4、mtDNA基因的突变携带率分别是3%、2%～3%、约0.33%，其中GJB2的携带率为最高[20]。本课题主要针对中国国情的聋病背景，展开研究试验，探讨Sanger测序法与导流杂交技术在检测非综合征性耳聋患者的最常见致病基因GJB2[4]突变情况的差异。根据本研究成果显示，Sanger测序法检测GJB2基因突变的总检出率为38.78%，致病突变检出率为19.39%，等位基因检出率为29.08%；而导流杂交技术的总检出率为33.68%，致病突变检出率为20.00%，等位基因检出率为26.84%。2种方法学的检出率均远大于聋病分子流行病学的调查结果，其主要原因：全国性聋病分子流行病学的调查主体是面向全国人民，而本次研究材料只针对凯普公司的收检聋病检测样本，检测对象的群体属性大有不同。针对本研究课题的实验结果，Sanger测序法的总检出率大于导流杂交技术（χ2=4.167，P=0.031），其原因主要是：DNA测序“金标准”的Sanger测序法能检测GJB2基因中第二个外显子的全部基因组序列，能实现对该基因组上所有位点的测序检测，能发现的未知突变位点更多，检测范围更广[15]，而导流杂交技术只特异性地针对GJB2基因最常见的5个致病位点突变情况进行检测，相较于测序法，检测范围上有较大的局限性，对于在此检测范围外的GJB2基因突变无法进行识别检测，因此，对于同一样本，导流杂交技术的检出率的确要比Sanger测序法低。然而，实验结果中，出现了导流杂交技术的致病突变检出率高于Sanger测序法，其原因可能是：（1）同一样本量，2种方法学成功检出的例数不同，Sanger测序法为98例，导流杂交技术只有95例，存在计算基数的差异，从而导致百分比的计算结果产生偏差；（2）实验研究选取的样本量较少，可能存在GJB2基因致病突变检测的局限，部分比较罕见的致病突变并没有在该样本中体现出来，导致最终2种方法学在致病突变的检测例数相同。因此，下一步的研究方向是适当扩大样本量，进一步验证Sanger测序法在检测GJB2基因突变的高特异性，才可证实本次研究中致病突变检出率的异常缘由。此外，本研究实验中，通过3组平行实验设计，展现了2种方法学在检测GJB2基因突变上均具有良好的重复性。从重复性结果可得：Sanger测序法的准确性（100%）高于导流杂交技术（90%）。这除了与Sanger测序法的高特异性优点存在一定关联，还可能与样本本身有关：（1）从实验数据中，不难发现，导流杂交技术检测不出的2例样本的纯度（A260/280）均小于1.60，浓度也比较低，DNA含量较少，这可能是导致导流杂交检测失败的原因；（2）在进行PCR扩增，加样前对DNA的震荡，可能导致了DNA片段化，造成比较差的扩增效果，从而影响了杂交结果；（3）导流杂交之前，需要对DNA进行加热变性，可能加热时长不够，导致DNA不完全变性成单链，从而出现显色较弱或杂交结果无法识别。具体的问题分析解决还需进一步设计实验验证。从灵敏度的设计试验的结果看，在相同的检测范围内，两种方法学的总体可识别率为78.57%。而Sanger测序法检测结果的可识别率只有57.14%，远小于导流杂交技术的可识别程度（100%），通过医学统计学的R×C列联表资料χ2检验，χ2值为15.54，P值为0.001，表明该统计对比具有统计学意义。导流杂交技术在DNA浓度为1ng/ul，仍能检测出突变情况，充分体现其高灵敏的突出优点，这在血斑卡或质量较差的原始样本类型提取DNA的聋病检测上占有较大的优势：一般地，对于常见突变位点检测的血斑卡样本，血斑卡上患者提供的血液量远小于EDTA-全血样本，这可能导致提取浓度偏低，该情况下，相对于应用Sanger测序可能因DNA含量达不到检出限而导致最终检测失败，应用导流杂交技术，对特定位点进行检测，能够弥补样本DNA质量较差的检测条件对结果产生的客观影响。Sanger测序法在DNA浓度为3ng/ul，均检测不出结果，主要在于该浓度下，经过PCR扩增后，产物DNA的含量仍低于其检出限。但由于原始样本量的不足、研究实验时间上的不允许，该实验设计中对浓度稀释存在着一定的局限，没有设计在3ng/ul～5ng/ul区间的稀释浓度，故不能判定Sanger测序法的检出限为5ng/ul。对于Sanger测序法的检出限还需进一步设计实验研究。

结论在针对中国国情的耳聋背景，检测非综合征聋病患者常见的致病基因GJB2的突变情况，Sanger测序法与导流杂交技术对已知和未知突变的检测均具有良好的重复性。不同的是：Sanger测序法具有高特异性、高准确性、高通量的明显优点，能实现对GJB2基因第二外显子的所有未知突变位点的检测，适合于临床GJB2基因的精确体外诊断。但由于该法操作繁琐，检测时间长，实验成本高，并不适合于大规模的临床筛查检测。相反地，导流杂交技术的优势在于操作简便易掌握，检测周期短，实验损耗少，并且灵敏度高，适合于临床上大样本量的筛查；但由于只针对GJB2基因最常见的5个致病的单位点突变情况进行检测，相较于测序法，检测范围上有较大的局限性，对于此范围外的GJB2基因上的突变无法进行检测。因此，对于遗传性聋病检测，可通过导流杂交平台对最常见的致病突变进行筛查，而对于怀疑是稀有突变造成的耳聋，测序法则可以进行补充，通过特异性引物自主设计，能对整个目的片段的序列进行检测，从而发现并查明相关的疑似突变，实现对整个目的DNA片段序列的全面检测。综上所述，2种方法学结合起来检测非综合征聋病患者常见的致病基因GJB2的突变情况，结果更为可靠、准确、科学，实现了高效率、高准确性、高灵敏度的临床诊断，构建出更为科学、合理的聋病基因诊断技术平台，进而为临床诊断治疗提供安全﹑有效的科学依据。

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