层级Ⅲ　强化真应用•落脚实践解决问题

价值引领CRISPR/Cas9基因编辑系统是21世纪最为重要的生物学发现之一。依托基因编辑这种影响深远的基因工程技术，引导学生感知基因编辑技术的发展历程，掌握基因编辑技术的基本原理，尝试应用基因工程的技术和方法提出工程学构想，分析设计基因编辑的技术方案，评价基因编辑技术带来的安全性问题和伦理问题，提升学生的核心素养和树立科学、技术与社会理念。活动目标(1)通过了解基因编辑技术的发展历程，体验基因工程的技术、方法选择，发展工程学思维。(2)通过分析基因编辑技术的原理，树立生命的物质观、信息观等生命观念，同时发展模型和建模、创造性思维等科学思维。(3)通过设计基因编辑方案，提升科学探究能力。(4)通过讨论基因编辑技术应用的安全性和伦理问题，培树社会责任。情境素材概述基因编辑是指对目标基因进行删除、替换、插入等操作，以获得新的功能或表型；基因编辑是生命科学领域的革命性技术，基因编辑技术的开发及应用，特别是第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术的发现，使得对生物体的遗传改造进入了前所未有的深度与广度，其成果转化也正在全球范围内高速推进。资料一同源重组是最早用来编辑细胞基因组的技术方法。同源重组是指DNA的两条相似(同源)链之间遗传信息的交换(基因重组)。带有与待编辑基因组部分相似的基因组序列的DNA片段一旦进入细胞，便可与细胞的DNA重组，取代基因组的目标部分，称为基因敲除，也叫基因打靶。这种方法的缺点是效率极低，且出错率高。资料二传统的基因编辑技术可以简单总结为3个步骤：(1)基因编辑工具的定位；(2)通过核酸酶介导的DNA损伤(一般会产生DNA双链断裂DSB)；(3)通过细胞内DNA损伤修复机制介导的DNA修复，达到基因组删除、插入、基因点突变的目的。基因编辑技术的发展历程如下：第一代：锌指核酸酶技术(ZFNs)。锌指核酸酶(一种蛋白质)比用于同源重组的DNA序列具有更强的稳定性，最经典的锌指核酸酶是将一个非特异性的核酸内切酶FokⅠ与含有锌指的结构域进行融合，其目的是对特定序列进行切割。被切开的DNA可以由切除的修复机制使切开处的单链部分被删除，然后又重新接到一起。理论上讲，可以利用这种方法完成对染色体上特定片段的删除，从而达到构造突变体或完成治疗的目的。ZFNs识别模式示意图：第二代：转录激活因子样效应物核酸酶技术。转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)是一种可靶向修饰特异性DNA序列的酶，它借助于TAL效应子(一种由植物细菌分泌的天然蛋白)来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别(设计和生产极其复杂)和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异性位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。TALENS识别模式示意图：第三代：CRISPR/Cas9基因编辑技术。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因敲除、基因纠正、突变引入等。编辑过程：sgRNA(向导RNA)引导Cas9蛋白找到目标DNA。当sgRNA和目标DNA相匹配时,Cas9蛋白会对DNA进行切割，细胞通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基的插入、删除,进而实现基因的敲除、修复或替换。CRISPR/Cas9识别模式示意图：活动项目(一)分析基因编辑的原理，培养科学思维1．分析资料一，同源重组的发生是由于在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体修复DSB的过程。这种现象在细胞分裂过程中最常发生在哪个时期？提示：减数分裂Ⅰ的四分体时期(或减数分裂Ⅰ的前期，联会和互换时)。2．分析资料二中锌指核酸酶技术(ZFNs)，每个FokⅠ单体与3个锌指蛋白单元相连，构成一个ZFN，作用机理如下图：一个ZFN的组成和功能是什么？2个ZFN形成的二聚体发挥什么作用？提示：一个ZFN由1个FokⅠ单体和3个锌指蛋白单元组成，其功能是识别DNA的特定碱基序列。2个ZFN形成二聚体能在特定位点断开DNA(具有酶切功能)。3．TALENs技术是利用TALE作为DNA识别域，用FokⅠ二聚体定点切断DNA，作用机理如下图：结合TALENs技术分析，资料二中说FokⅠ是非特异性的核酸内切酶的原因是什么？提示：TALE蛋白能识别DNA的特定序列，FokⅠ二聚体与TALE蛋白结合后才能对DNA进行特异性切割。4．与ZFNs技术和TALENs技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术中识别目标基因序列的结构在化学成分上有什么不同？提示：前两者是蛋白质，后者是RNA。5．CRISPR/Cas9识别模式示意图中的sgRNA可以称为向导RNA，推测sgRNA序列长短与基因编辑技术成功率具有什么关系？提示：序列越短，基因编辑技术成功率越低(或序列越长，基因编辑技术成功率越高，即错误识别率越低)。

思维建模·触类旁通图解基因编辑技术的原理活动项目(二)分析基因编辑方案，学会科学探究、发现并解决问题1．为研究小鼠细胞中基因X的功能，科学家通过同源重组法将小鼠胚胎干细胞中的基因X的活性消除并获得嵌合体小鼠。在制备置换载体时，将neor基因(抗新霉素基因)作为置换基因X的插入突变，同时在neor基因外侧添加HSV-tk基因，该基因的表达产物能将DHPG转化为有毒物质从而使细胞死亡，如图甲所示。置换载体导入ES细胞后，可发生同源重组和非同源重组，如图乙所示。(1)根据图甲可知，在构建基因X的置换载体时，需用相同的限制酶切割基因X和neor基因，该酶的切割位点应位于这两个基因的哪里？用相同酶切的目的是什么？提示：基因X的内部和neor基因的两端。产生相同的末端，便于被DNA连接酶连接。(2)将置换载体导入ES细胞后，如何将发生同源重组的ES细胞筛选出来？并简述理由。提示：在培养基中加入新霉素和DHPG，培养导入置换载体的细胞。未成功导入的ES细胞中不含neor基因，不抗新霉素，所以在培养基中无法存活。成功导入，但发生非同源重组的ES细胞中，HSV-tk基因可以表达，其产物会将培养基中的DHPG转化为有毒物质从而杀死ES细胞。只有发生同源重组的ES细胞，含有neor基因，同时无HSV-tk基因，可以在培养基中存活。2．根据科研人员对CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用和改造，回答相关问题：(1)Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图1)。Cas9蛋白能精准识别并切割目的基因的原因是____________________________________________________________________________________________________。Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发的变异类型是__________。提示：sgRNA能与目的基因的核苷酸序列发生碱基互补配对基因突变(2)将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因(RFP基因)上游不同部位结合的sgRNA序列(如图2)，并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。依据该实验结果可以得出什么结论？提示：sgRNA结合部位距离转录起始点越近，抑制目的基因表达的作用越强。(3)VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案：__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。提示：根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体，然后导入细胞(4)请总结写出CRISPR/Cas9及其改造产品在科学研究中的应用：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。提示：利用CRISPR/Cas9及其改造产品可实现定点诱变、抑制某些有害基因(或致病基因)的表达、促进特定基因的表达等。思维建模·触类旁通CRISPR/Cas9系统及其技术开发思路活动项目(三)关注基因编辑的安全性和伦理问题，培树社会责任1．根据CRISPR/Cas9基因编辑原理，该技术最大的安全隐患是什么？提示：sgRNA可能与细胞内目标基因以外的DNA序列结合导致正常基因被破坏。2．某科研团队曾将体外受精的人受精卵进行基因编辑，声称获得了出生后即能天然抵抗艾滋病的个体，即“基因编辑婴儿”。有部分专家指出，这样的基因编辑婴儿是否真的天生有抗HIV能力，还不能完全确定，做出此判断的原因是什么？提示：不能通过HIV感染实验进行验证(不能通过实验验证)。3．基因编辑技术用于人类遗传病治疗给患者带来了光明的前景，但同时该技术用于人类基因编辑又给人们带来无限的担忧。你能举例说明人们担忧的原因吗？提示：一方面在改变致病基因的同时可能导致正常基因受损；另一方面该技术可能会被滥用等。[典例]

(2023·天津高考，有改动)基因工程：制备新型酵母菌(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，[信息①]推测这些酶生效的场所应该是________(填“细胞内”或“细胞外”)。(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。[信息②]研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物________对目的基因进行PCR。(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质。[信息③]Ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在____________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式________进行连接。Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在________的培养基上筛选培养。(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图________。

解题关键—破译新情境[解析]

(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。(2)根据题干信息可知，当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同(都含有同源序列A、B)，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。(3)Ⅰ.选择了尿嘧啶合成基因(UGA)作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。Ⅱ.由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上筛选切去UGA基因的酵母菌，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。(4)根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。[答案]

(1)细胞外(2)P1和P6

(3)Ⅰ.缺乏尿嘧啶2

Ⅱ.含有5-氟乳清酸(4)3[考情聚焦]素材选择选材常借助生产、生活情境和科学探索情境，围绕基因工程的基本操作，选择不同的情境对基因工程的工具、技术方法及原理展开考查。试题多采用图文结合的形式，使学生能更好地获取陌生信息，减少审题负担题点分布基础考法以考查识记类知识点为主，且多是单个知识点的考查。涉及到基因工程的基本工具、方法技术等，主要包括：①DNA重组技术的三种基本工具；②基因工程的基本操作程序；③PCR技术的原理等。如：2023山东卷T25(1)，2023全国甲卷T38(2)，2023天津卷T16(1)等题点分布综合考法通常需要运用2个及以上的知识点解答，还经常联系遗传与变异的知识进行综合考查。主要涉及的教材内容包括：①构建特殊需要的基因表达载体；②目的基因表达产物的检测与鉴定；③PCR技术与引物的设计等。如：2023全国甲卷T38(4)，2023湖南卷T19(2)，2023北京卷T19(2)等续表题点分布应用、创新考法这类考法以解决实际问题为主，或设置探究新问题，且命题形式多采用紧密结合生活、生产的新情境。常见但不限于以下情境：①基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用；②蛋白质工程与基因工程的联系；③利用基因工程技术调控基因表达的不同方法；④运用PCR技术对基因进行定点诱变；⑤应用CRISPR/Cas9技术等进行基因编辑。如：2023北京卷T21(3、4)，2023全国乙卷T38(4)，2023海南卷T20(4、5)等续表[强化训练]1．CRISPR/Cas9系统由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成，由向导RNA引导Cas9蛋白在特定的基因位点进行切割来完成基因的编辑过程。用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。下图为基因编辑猪的培育流程，回答下列问题：(1)由于Cas9蛋白没有特异性，用CRISPR/Cas9系统切割靶基因时，向导RNA的识别序列应具有的特点是___________________________________________________________。若向导RNA为5′-UCCACAAUC-3′，则向导RNA识别的基因靶序列为5′-______________________-3′。CRISPR/Cas9基因编辑技术有时会出现定位错误造成脱靶。通常，向导RNA的碱基序列越短脱靶率越高，原因是______________________________________________________________________________________________________________________。(2)研究发现，基于体细胞核的动物克隆难度高于基于胚胎细胞核的动物克隆，原因是_______________________________________。为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行_____________，此操作需要特别注意的是_____________________________________。(3)基因编辑前，采集2号猪的组织块﹐用________________________________处理获得分散的成纤维细胞，放置于37℃的CO2培养箱中培养。动物细胞培养液的成分与植物组织培养基成分最主要的区别在于前者一般含有________。解析：(1)由于Cas9蛋白没有特异性，用CRISPR/Cas9系统切割靶基因时，向导RNA的识别序列应具有特异性，即具有特定的碱基序列与靶基因特定序列通过碱基互补配对结合。若向导RNA为5′-UCCACAAUC-3′，结合图示可知，向导RNA识别的基因靶序列为5′-TCCACAATC-3′。通常，向导RNA的碱基序列越短脱靶率越高，这是因为向导RNA的碱基序列越短，与DNA上除靶序列外的其他部位结合的概率越大，或DNA上除靶序列外含有与向导RNA互补配对序列的概率增大，向导RNA与靶基因结合的机会减少，因而造成向导RNA脱靶率增大。(2)研究发现，动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此基于体细胞核的动物克隆难度高于基于胚胎细胞核的动物克隆。为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行胚胎分割，从而通过无性繁殖获得更多的转基因猪，选择囊胚期的胚胎进行分割时，注意将内细胞团均等分割，否则会影响胚胎的发育。(3)基因编辑前，采集2号猪的组织块，由于动物细胞间的物质主要是蛋白质，因此用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理获得分散的成纤维细胞，放置于37℃的CO2培养箱中培养。动物细胞培养液的成分与植物组织培养基成分最主要的区别在于动物细胞培养液中需要添加动物血清。答案：(1)能与靶基因特定序列通过碱基互补配对结合TCCACAATC

DNA上除靶序列外的其他部位含有与向导RNA互补配对序列的概率增大，造成向导RNA脱靶率增大(2)动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难胚胎分割选择囊胚期的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割(3)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)血清2．(2023·岳阳二模)玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，回答下列问题。(1)利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增P基因，需要的引物有____________(从A、B、C、D四种单链DNA片段中选择)。(2)培育超量表达P蛋白的转基因玉米过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图2所示(Ti质粒上的T-DNA可转移到被侵染的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上)。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用___________________________酶组合，理由是_____