生物化学教学课件

生物化学蛋白质蛋白质的组成单位氨基酸

二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构蛋白质的一级结构蛋白质的高级结构蛋白质的理化性质和分离纯化技术一、蛋白质的基本结构单位——氨基酸

氨基酸(aminoacid，aa)是蛋白质多肽链的基本结构单位，或称构件分子、构造单元（buildingblock）。

蛋白质是成百上千个氨基酸分子以肽键相连，组成的长链分子（多肽链）。•结构通式：(脯氨酸除外)

－aa（一）常见氨基酸（20种）的结构及分类(兼性离子形式)（中性分子形式）

•分类脂肪族aa（15）芳香族aa(3)杂环族aa(2)一氨基一羧基aa：Gly,Ala,Val,Leu,Ile含羟基aa：Ser,Thr含硫aa：Cys,Met含酰胺基aa：Asn,Gln一氨基二羧基aa(酸性aa)：Asp,Glu二氨基一羧基aa(碱性aa)：Lys,ArgPheTyrTrpHisPro++-根据R基化学结构和极性分类黑色：非极性R基氨基酸绿色：极性R基氨基酸—一氨基一羧基氨基酸脂肪族氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）—羟基氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）—含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）—含酰胺基氨基酸（天冬酰胺、谷氨酰胺）—一氨基二羧基氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）—二氨基一羧基氨基酸（赖氨酸、精氨酸）芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）杂环族氨基酸（组氨酸、脯氨酸）咪唑基（二）氨基酸的物理性质都为白色晶体，不同氨基酸结晶形状不同。熔点很高，一般在200℃以上。溶解度：大多数氨基酸都溶于水。Pro溶解度最大，其次为lys,Arg。胱氨酸和Tyr的溶解度较小。氨基酸由于具有不对称碳原子，所以具有旋光性。Tyr、Phe和Trp在近紫外区(220-300nm）有光吸收。

蛋白质

max=280nm氨基酸溶解度（25℃，g/L）脯氨酸(Pro)1620精氨酸(Arg)855.6赖氨酸(Lys)739丝氨酸(Ser)422半胱氨酸(Cys)280甘氨酸(Gly)249.9丙氨酸(Ala)167.2缬氨酸(Val)58.1甲硫氨酸(Met)56.2组氨酸（His）41.9异亮氨酸(Ile)34.5天冬酰胺(Asn)28.5苯丙氨酸(Phe)27.6亮氨酸(Leu)21.7色氨酸(Trp)13.6苏氨酸(Thr)13.2谷氨酸(Glu)8.5谷氨酰胺(Gln)(37℃)7.2天冬氨酸(Asp)5酪氨酸(Tyr)0.4氨基酸的溶解度指出在正丁醇：醋酸：水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的迁移率：

(1)Ile,Lys(2)Ala,Val,Leu(3)Pro,Val(4)Tyr,Ala,His答：Rf：Ile＞LysLeu＞Val＞AlaVal＞ProTyr＞Ala＞His•

氨基酸在晶体和水中主要以兼性离子存在。（三）氨基酸的酸碱性质

氨基酸的两性解离

氨基酸是一类两性电解质，它既起酸（质子供体）的作用，又起碱（质子受体）的作用。中性氨基酸的解离（以Gly为例）阳离子（A+）兼性离子（A0）K1兼性离子（A0）阴离子（A–）K2注：K1和K2分别为-COOH和-NH3+的解离常数Handerson-Hasselbalch公式pH=pKa[质子受体][质子供体]=1-COO--COOH静电荷-0.5-NH2-NH3+静电荷+0.5pH-pKa=1[质子受体][质子供体]=10-COO-

-COOH静电荷-1-NH2

-NH3+静电荷0pH-pKa=-1[质子受体][质子供体]=0.1-COO--COOH静电荷0-NH2-NH3+静电荷+1判断在任何pH条件下氨基酸各种基团的带电状态。pK1=2.19pKR=4.25pK2=9.67pK1=1.82pKR=6.0pK2=9.17His在pH7处有显著的缓冲能力酸性氨基酸的解离（Glu为例）碱性氨基酸的解离（His为例）pK1=2.34pK2=9.60中性氨基酸的解离（Gly为例）pH=pIpH>pIpH<pI

电场中静电荷+

0

-不移动移向正极移向负极

氨基酸的等电点（isoelectricpoint,pI）•在一定pH范围内，pH离pI越远，氨基酸所带静电荷越大；

利用各种aa的pI不同，可通过电泳法、离子交换层析法进行分离。

调节溶液pH值，使氨基酸处于兼性离子状态，此时氨基酸所带正负电荷数相等，即净电荷为0，在电场中既不向阳极又不向阴极移动，这时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。定义pK1pK2pKRpI侧链不解离中性氨基酸2.0~3.09.0~10.05~6酸性氨基酸AspGlu2.092.199.829.673.864.252.973.22碱性氨基酸ArgLysHis2.172.181.829.048.959.1712.4810.536.0010.769.747.59pI为兼性离子两侧相应解离基团pK

的算数平均值。

与2，4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB）的反应弱碱中DNP-氨基酸（黄色）Sanger试剂此反应是Sanger法鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸的依据。(四)氨基酸的化学反应

-NH2参加的反应与苯异硫氰酸酯（PITC）反应

此反应是Edman法鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸的依据，在aa序列分析方面占有重要地位。苯乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）PTC-aa

-氨基、α-羧基共同参加的反应紫色物质注意：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质。水合茚三酮此反应用于定性、定量鉴定氨基酸。茚三酮反应成肽反应肽键4.侧链R基参加的反应

氨基酸R基上的功能团也能发生化学反应。功能团：

羟基（Ser,Thr）巯基(Cys)苯基（Tyr,Trp）酚基(Tyr)吲哚基（Trp）咪唑基(His)胍基（Arg）甲硫基(Met)非

-NH2(Lys)非

-COOH(Asp,Glu)巯基易被空气或其它氧化剂氧化胱氨酸在稳定蛋白质空间构象上发挥很大作用二硫键注意：二硫键可被氧化剂和还原剂打开2+6HCOOH2+R—S—S—R2R—SH磺基丙氨酸巯基乙醇二硫苏糖醇（DTT）6HCOOOH过甲酸二、蛋白质的一级结构氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）一级结构定义：蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和连接方式。氨基酸残基1.肽的结构通式例：胰岛素的一级结构[英]Sanger等，1953FrederickSanger3对二硫键A链：21aaB链：30aa0.36nm2.肽键C-N键具有部分双键性质肽键一般为反式构型肽平面HH

Thetransandcisisomersofapeptidebondinvolvingtheaminonitrogenofproline.Over99.95%ofthepeptidebondsbetweenaminoacidresiduesotherthanProareinthetransconfiguration.

位阻排斥3.肽的物理和化学性质物理性质酸碱性质化学反应茚三酮反应、双缩脲反应主要取决于游离末端的

-NH2和

-COOH及R基上可解离基团。短肽为晶体，熔点很高。在水溶液中以兼性离子形式存在。具旋光性。例：试判断Gly-Glu-Lys-Ala在pH6.0时的带电状态。pK´=7.8pK´=4.6pK´=10.2pK´=3.7

答：-NH2-COOH-NH2--COOHpH6.0+-+-所以，在pH6.0时，此四肽所带静电荷为“0”胰蛋白酶：R1=

Lys,ArgR2Pro麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=

Phe,Trp,TyrR2Pro胃蛋白酶：R1,R2=Phe,Trp,Tyr,Leu等R1Pro嗜热菌蛋白酶：R2=Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,MetR2Pro,Gly肽链内切酶4.肽链的断裂——酶解法和化学裂解法酶解法肽链外切酶氨肽酶羧肽酶CNBr：羟胺(NH2OH)：断裂Asn-Gly之间的肽键

化学裂解法R1=

Met,生成肽酰高丝氨酸內酯

部分裂解Asn-Leu和Asn-Ala之间的肽键三、蛋白质的高级结构维持蛋白质高级结构的作用力主要是较弱的相互作用，即非共价键或次级键。

包括：

氢键、范德华力、疏水相互作用、盐键（离子键）二硫键在维持蛋白质构象中也发挥重要作用。

可在多肽主链的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水之间等处形成。

氢键（hydrogenbond）

Somehydrogenbondsofbiologicalimportance.•包括三种较弱的作用力:定向效应：极性分子(或基团)之间诱导效应：极性和非极性分子(或基团)之间分散效应：非极性分子(或基团)之间•

范德华距离（接触距离，contactdistance）

范德华引力只有在两个非键合原子处于一定距离才能达到最大，这个距离称为范德华距离。等于两个原子的范德华半径之和。

范德华力很弱，但具有加合性。

范德华力（vanderWaalsforce）

疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近，这种现象称为疏水相互作用。

定义:

变性剂（尿素、非极性溶剂、去污剂等）可破坏疏水相互作用。

疏水相互作用（hydrophobicinteraction）F=(Q1Q2)/(εR2)Q1，Q2:电荷电量ε：介质的介电常数R:电荷质点间的距离

定义:正、负电荷之间的一种静电作用。

生理pH条件下，酸性aa带负电荷，碱性aa带正电荷。在分子的疏水内部，带相反电荷的侧链可形成盐键。

盐键:又称离子键（ionicinteractions）

对蛋白质的三级结构起稳定作用。

二硫键(disulfidebridge)(一)蛋白质的二级结构(seconarystructure)

-螺旋（

-helix）

-折叠（

-pleatedsheet）

-转角（

-turn）

-凸起

(-bulge)无规卷曲（randomcoil）

定义：指多肽链借助H键折叠盘绕成沿一维方向具有周期性结构的构象。

常见类型：Althoughhelices（螺旋）arenotuncommoninmanmadearchitecture,thereareacommonstructurethemeinbiologicalmacromolecules—protein,nucleicacids,andevenpolysaccharides（多糖）.

-螺旋（

-helix）0.54nm0.15nm0.5nm

-螺旋的结构要点：1）多肽主链沿中心轴盘绕成右手或左手螺旋；2）每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm，每个氨基酸残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm；螺旋直径0.5nm;3）

-螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧；4）相邻螺旋间形成氢键，氢键几乎与螺旋的长轴平行，是由肽键上酰胺氢与其前面N端第四个残基上羰基氧之间形成。[NH-C

H-CO]3CNOH3.613-螺旋影响

-螺旋形成的因素R基的电荷性质：同种电荷可产生静电斥力。例：多聚Lys(pH7)。R基的结构：例：Pro、Hyp可中断

-螺旋。R基的大小：R基大，空间位阻大。例:多聚Ile

-折叠片（

-pleatedsheet）

-折叠股1）肽链主链取锯齿状折叠构象。2）两条或多条多肽链之间侧向聚集在一起，相邻多肽链羰基氧和酰胺氢之间形成氢键，氢键与肽链的长轴几乎成直角。3）侧链R基交替分布于片层平面两侧。4）肽链的走向可以是平行的，也可以是反平行的。

-折叠结构要点：平行反平行

-转角（

-turn）AB

TheStructuresoftwokindsofβ-turns.含有4个氨基酸残基。第一个残基的羰基氧和第四个残基的酰胺氢之间形成氢键。Gly和Pro

常在

-turn中出现。

-转角结构要点：

-转角可改变肽链走向。

-凸起（

-bugle）

大多数作为反平行β折叠中的一种不规则情况。可认为是β折叠股中额外插入一个残基。

无规卷曲（randomcoil）多具有明确、稳定的结构。常构成酶的活性部位和蛋白质的特异功能部位。

钙结合蛋白中的E-Fhand结构

（二）超二级结构

蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（如

-螺旋、-折叠、-转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，以充当三级结构的构件，称为超二级结构。

三种基本组合形式：

、

、

。

定义

Rossman折叠

（

-螺旋束）2-4股右手

-螺旋相互缠绕形成左手超螺旋连接链

折叠股

-螺旋

-meanderGreekkeytopologyrare(回形拓扑结构

)(

–曲折)

-hairpin(-发夹)连接链是

-转角（三）结构域（structuredomain）

定义对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种独立的折叠单位称为结构域。单结构域多结构域一般含100-200个氨基酸残基。例：肌红蛋白（153aa）例：己糖激酶（约1000aa）2个结构域Theconformationalchangeinducedinhexokinasebythebindingofasubstrate(D-glucose,showninred).己糖激酶两个结构域之间为一个裂缝（四）蛋白质的三级结构定义：含有多种二级结构元件，具有明显的折叠层次。紧密的球状实体，但活性部位具松散区域，以利于构象变化。疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。分子表面有一个空穴（裂缝、口袋、凹槽），是结合配体并行使生物学功能的部位。共同特征：

指多肽链在二级结构的基础上借助各种次级键进一步盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。一级结构：Mr.16700，含153aa,由一条多肽链和一个血红素辅基组成。

二级结构：

-螺旋：8段，命名为A,B,C…..H

松散肽段：位于螺旋之间和C末端三级结构：8个螺旋段大体分成两层，整个分子紧密结实，分子内部仅能容纳4个水分子。Mb是哺乳动物肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。例：肌红蛋白(Mb)的三级结构

血红素（heme）结合的位置

位于肌红蛋白表面的疏水洞穴内。疏水微环境可防止Fe（II）被氧化成Fe（III）从而失去载氧能力。血红素（Fe-原卟啉IX）卟啉血红素（铁原卟啉IX）

由原卟啉IX与一个Fe原子（II或III）组成。吡咯环甲叉桥Fe（II）有六个配位键，四个与卟啉N结合，第5个与F8His残基的咪唑N结合，第6个呈开放状态，是O2的结合部位，其附近为E7His。因E7His的存在而产生的空间位阻可降低血红素对CO的亲和力。（五）蛋白质的四级结构定义

具三级结构的球状蛋白质以非共价键缔合在一起，形成的聚集体称为蛋白质的四级结构。其中每个球状蛋白质称为亚基。

指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质生物活性的现象。

寡聚蛋白质与别构效应例：血红蛋白的结构和功能（1）寡聚蛋白质:Mr.65000。具四个亚基（

2

2

），每个亚基与一个血红素分子结合。（2）一级结构:

:141aa:146aa9个保守残基：F8His(87,92)、

E7His（58,63）等（3）二、三级结构：和链与Mb相类似

亚基间具8个盐桥两个

亚基与1分子BPG

(2,3-二磷酸甘油酸)形成8个盐桥（4）四级结构：

分子近球形，四个亚基占据四面体的四个角，以盐键相连。

由于这些盐桥，血红蛋白在未与氧结合之前，分子构象受到很大束缚。Thethree-dimensional(quaternarylstructureofdeoxyhemoglobin.(a)Aribbonrepresentation.(b)Aspace-fillingmodel.Theαsubunitsareshowninwhiteandlightblue;theβsubunitsareshowninpinkandpurple.Notethatthehemegroups,showninred,arerelativelyfarapart.Conformationaldrawingsoftheα-andβ–chainsofHbandthemyoglobinchain.Saltbridgesbetweensubunitsinhemoglobin.Thestructure,inionicform,ofBPG.TheionicbindingofBPGtothetwo

-subunitsofHb.带负电的BPG

与每个链的带正电荷的基团相互作用：Val1(NA1)His2(NA2)Lys82(EF6)His143(H21)等（5）血红蛋白的功能与别构效应

氧和前，脱氧血红蛋白Fe原子半径较大，且由于空间排斥和静电排斥，使得Fe原子突出在卟啉环中央孔穴之外。氧和后，Fe原子半径缩小，向卟啉环中央孔穴内移动0.039nm。空间效应氧合引起血红蛋白构象变化。Fe原子移动，并通过F8His牵引所在肽链，使亚基间空间位置发生改变。盐键断裂，两个原体发生相对滑动，分子从紧张态转变为松弛态，对氧的亲和力增强。电子效应空间排斥静电排斥0.06nm0.021nmFe原子向卟啉环平面移动0.039nmChangesinthepositionofthehemeironatomuponoxygenationleadtoconformationalchangesinthehemeglobinmolecule.Subunitmotioninhemoglobinwhenthemoleculegrowsfromthe(a)deoxytothe(b)oxyform.氧和后，一个原体固定不动，另一个原体绕偏心轴旋转15°，平移0.08nm

Thetenseandrelaxstateofhemoglobin.Theoxygen-bindingcurves（氧合曲线）ofMbandHb.p(O2)/torrSaturationwithO2(Y)肺泡中p(O2)工作肌肉毛细血管中p(O2)Y=0.97Y=0.25Hb△Y=0.72Mb△Y＜0.1S形曲线正协同效应四、蛋白质的理化性质及分离纯化技术1.蛋白质的大小和分子量蛋白质分子量:

6000——1106

道尔顿，甚至更大。对于简单蛋白质：氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量/110氨基酸残基平均分子量128-18

蛋白质的分子量也可用沉降系数表示。沉降系数（S）：单位离心场下的沉降速度。1S=10-13秒蛋白质、核酸、核糖体的沉降系数介于1~200S之间。2.蛋白质的酸碱性质蛋白质是两性电解质。可解离集团主要来自侧链上的功能团。蛋白质的等电点蛋白质在等电点时溶解度最低。利用蛋白质的带电性质，可采用电泳法和离子交换层析分离蛋白质混合物。胃蛋白酶卵清蛋白血清清蛋白乳球蛋白胰凝乳蛋白酶原溶菌酶脲酶3.蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀(1)蛋白质是亲水胶体。

水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。(2)蛋白质的沉淀（precipitation）：

破坏水化层与双电层的因素可破坏蛋白质胶体的稳定性而使其沉淀。方法试剂原理应用盐析法(NH4)SO4NaCl脱去水化层分级盐析沉淀蛋白质有机溶剂沉淀法重金属盐沉淀法生物碱试剂及某些酸沉淀法加热变性沉淀法沉淀蛋白质的方法及应用4.蛋白质的变性2.变性因素

物理因素：热、紫外线照射、高压等化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱定义：天然蛋白质分子在某些物理化学因素的影响下，次级键被破坏，天然构象解体，致使物化性质和生物学性质发生改变，这种现象叫蛋白质的变性。5.蛋白质的分离提纯细分级（finefractionation）前处理(pretreatment）粗分级（roughfractionation）

盐析等电点沉淀有机溶剂分级沉淀层析电泳

凝胶过滤离子交换层析亲和层析凝胶过滤(分子排阻层析)

层析洗脱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠网状结构，而最先流出柱外；比凝胶网孔小的分子可进入凝胶珠网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外。这样可使大小不同的分子得以分离。电泳技术

利用分子所带净电荷不同而加以分离的技术，称电泳技术。

在一定pH条件下，蛋白质分子可解离而带电。不同带电颗粒在电场中的泳动速度与带电量、颗粒大小和形状有关。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)兼有浓度、分子筛、电荷三效应，分辨率很高。浓缩胶分离胶双向电泳

核酸核苷酸脱氧核糖核酸（DNA）核酸的理化性质和研究技术核糖核酸（RNA）一、核酸的基本结构单位——核苷酸核苷核苷酸结构通式：（一）碱基（base）1.嘧啶碱2.嘌呤碱（二）核苷（nucleoside）戊糖核糖脱氧核糖核糖核苷H腺苷H鸟苷H胞苷H尿苷C1′-N9糖苷键C1′-N1糖苷键脱氧核糖核苷HHHH脱氧腺苷脱氧鸟苷脱氧胞苷脱氧胸苷（三）核苷酸（nucleotide）1.核糖核苷酸通式：N(A,G,C,U)5´-NMP腺苷酸（5´-AMP）鸟苷酸（5´-GMP）尿苷酸（5´-UMP）胞苷酸（5´-CMP）2.脱氧核糖核苷酸通式：(A,G,C,T)NH5´-dNMP脱氧腺苷酸(5´-dAMP)脱氧胸苷酸(5´-dTMP)脱氧鸟苷酸(5´-dGMP)脱氧胞苷酸（5´-dCMP）3.多磷酸核苷酸（5´-核苷二磷酸）（5´-核苷单磷酸）（5´-核苷三磷酸）NMP/NDP/NTPdNMP/dNDP/dNTP4.环化核苷酸3´,5´-环式腺苷酸（环腺一磷)3´,5´-环式鸟苷酸（环鸟一磷)第二信使二、脱氧核糖核酸

（deoxyribonucleicacid,DNA）

（一）DNA的一级结构

定义：

指由数量极其庞大的4种脱氧核糖核苷酸以3´,5´-磷酸二酯键连接形成的线形或环形分子。常指DNA分子中核苷酸的排列顺序。pApTpGpCpA…或pA-T-G-C-A…结构特点：核苷酸之间的连接方式：3´,5´-磷酸二酯键DNA分子有极性：5´

3´

不同DNA分子碱基的数目、比例、排列顺序千变万化。WatsonandCrick’spaperinNature1953.Watson,CrickandWilkins1962诺贝尔生理及医学奖（二）DNA的二级结构1.DNA双螺旋结构提出的主要依据关于碱基成对的证据：Chargaff法则

A和T的摩尔数相等，A=T。

G和C的摩尔数相等，C=G。（2）X-ray衍射分析数据

Thex-raydiffractionpatternofDNA.RosalindFranklin(1920-1958)1952,Wilkins和Franklin2.DNA双螺旋结构模型要点(1)两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴以右手盘绕成双螺旋结构。螺旋表面具大沟和小沟。大沟宽１.2nm,小沟宽０.6nm。

TheWatson-CrickmodelforthestructureofDNA.5′3′5′3′(2)在螺旋的外侧，脱氧核糖与Pi交替排列，彼此以3,5-磷酸二酯键相连，构成DNA分子的骨架，糖环平面与纵轴平行。由于磷酸基团带负电荷，两条多核苷酸链将可能因为静电斥力而相互分开，DNA分子是如何维持其稳定性呢？

BackboneofDNA（3）碱基对位于内侧，两条链上的碱基借助H键一一配对，A与T配对,形成两个H键，C与G配对，形成三个H键——以上碱基配对原则，称碱基互补（basecomplementary）。碱基平面与纵轴相垂直。

Thewatson-CrickbasepairsA:TandG:C.4361612234A:T,G:C碱基对可形成在空间上大小相等的单位。（4）双螺旋平均直径2nm，相邻碱基对平面间的距离为0.34nm，夹角36°，每旋转一周有10个核苷酸，螺距3.4nm。5′3′5′3′3.维持双螺旋结构稳定的因素碱基对之间的氢键碱基堆积力（basestackingforce）

碱基的疏水相互作用

范德华引力磷酸基团上负电荷与介质中的阳离子形成的离子键4.DNA双螺旋的不同类型A型B型Z型右旋左旋ComprisonofA,B,ZformsofDNA.ComprisonofA,B,ZformsofDNA.ABZ外型粗短适中细长螺旋方向右手右手左手螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm碱基轴升0.23nm0.34nm0.38nm碱基夹角32.7º34.6º60º每圈碱基数1110.412螺距2.53nm3.54nm4.56nm碱基倾角19º1º9º（三）DNA的三级结构

定义：

在双螺旋的基础上进一步螺旋化，形成超螺旋DNA。1.环形DNA

细菌染色体、质粒DNA、某些病毒DNA、线粒体和叶绿体DNA等为环形DNA。

ElectronmicrographsofrelaxedandsupercoiledplasmidDNAs.

超螺旋存在的意义：（1）超螺旋DNA具有更致密的结构，在细胞内所占体积更为经济。（2）负超螺旋导致DNA解链，有利于DNA参与复制、转录、重组等过程。天然DNA皆以负超螺旋形式存在。2.真核生物DNA（线形双链）的三级结构

StructureofDNA(146bp)wrappedaroundanucleosomecore.146bpDNA以左手螺旋在组蛋白核心上缠绕1.8圈。3.真核生物的染色体（1）染色质的基本结构单位是核小体（nucleosome）。Regularlyspacednucleosomes,consistingofhistonecomplexesboundtoDNA.(a)Schematicillutration;(b)electronrevealsthepresenceofnucleosomesas“beadsonastring.”核小体化学组成：碱性蛋白，富含碱性氨基酸(lys,Arg)，分为H1，H2A，H2B，H3，H4五类。非组蛋白：DNA:组蛋白:非组蛋白:RNA=1:1:0.6:0.1包括各种结构蛋白、参与复制与转录的蛋白等。组蛋白：（Histone）核小体的结构：核心桥146bpDNAH2A、H2B、H3、H4组成的八聚体连接DNA（linkerDNA）:20~80bpDNAH1(左手缠绕八聚体1.8圈)Adiagramofthehistoneoctamerandnucleosome.组蛋白八聚体（2）真核生物染色体组装的不同层次

核小体链进一步盘绕成染色质纤丝，由纤丝组成突环，并通过DNA结合蛋白（非组蛋白）与核骨架相连，再由突环组成玫瑰花结，进而组成螺旋圈，由螺旋圈再组装成染色单体。Probablestructureofthe30nmfiber(纤丝）.Amodelforlayersoforganizationinaeukaryoticchromosome.30nm纤丝（每圈6个核小体）150nm

突环（平均75000bp）300nm玫瑰花结(6个突环)700nm螺旋圈(每圈30个玫瑰花结)长度1400nm染色体11nm核小体链（每个核小体200bp）2nmDNA核骨架三、核糖核酸

（ribonucleicacid,RNA）(一)RNA的类型rRNA（占~80%）tRNA（占~15%）mRNA（占~5-6%）SnRNA核内小RNASnoRNA核仁小RNAvRNA病毒RNA(二)RNA的碱基组成RNA中除A、U、C、G外，还存在几十种稀有碱基。RNA类型碱基的相对含量（摩尔百分比）AGCU

甲基化碱基E.colirRNA25.231.521.621.7--E.colimRNA25.127.124.123.7--E.colitRNA18.330.330.315.92.42.2酵母tRNA19.426.625.120.14.63.1兔肝tRNA16.631.127.815.94.33.5伤瘤病毒RNA31.118.619.131.3--（三）RNA的结构

一级结构：即RNA的共价结构，核糖核苷酸以3’,5’磷酸二酯键连接形成的线性单链分子。

二级结构：由局部双螺旋区和非配对区（突环区）组成。三级结构：二级结构的进一步折叠1.tRNA的结构（1）Mr：25000左右，沉降系数：4S通常由73-93个核苷酸组成，含稀有碱基3´端为CpCpAOH（用来接受活化的氨基酸）（2）一级结构：（3）二级结构：三叶草形“四环一臂”TheseconarystructureoftRNA.Redlinespresentthehydrogenbonds.氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码子环额外环TC环含7bp，3´端为CCA，接受活化的氨基酸。含8~12b，2个D含7b，环中部为反密码子，由三个碱基组成。含3~18b，tRNA分类的指标含7b，几乎所有tRNA皆含TC。（4）三级结构：倒L型TC臂氨基酸臂D臂反密码子臂D环、TC环、额外环的某些碱基之间形成9对氢键，以维持tRNA三级结构的稳定。2.rRNA的结构rRNA的类型：原核生物rRNA16S5S23S70S核糖体真核生物18S5S5.8S

28S80S核糖体蛋白质（种）核糖体亚基2130S小亚基3450S大亚基~3040S小亚基~5060S大亚基rRNA的结构E.coli16SrRNArRNA的功能

构成核糖体的骨架。核糖体是蛋白质合成的部位。3.真核生物mRNA的结构特点：5´cap的功能：协助mRNA与核糖体的结合。3´poly(A)的功能：保护mRNA3´端免受核酸外切酶的降解。与mRNA由细胞核向细胞质的转移有关。m7G5’ppp5’Nm(Nm)(A)nOH5´非编码区3´非编码区编码区3´poly(A)5´cap(n:20~200)保护mRNA5´端免受核酸外切酶的降解。Cap0型（m7G5’ppp5’

）Methylationofseveralspecificsiteslocatedat5’-endofeukaryoticpre-mRNAsisanessentialstepinmRNAmaturation.

CapII型（m7G5’ppp5’N1mpN2mp）CapI型（m7G5’ppp5’N1mp）绝大多数真核生物四、核酸的理化性质和研究技术1.分子大小：核苷酸分子量：脱氧核苷酸对

618D；核苷酸对

670DDNA和RNA皆是高分子量物质。2.溶解性：

DNA、RNA微溶于水，不溶于一般有机溶剂。3.特殊颜色反应（一）核酸的理化性质核酸的溴化乙锭（EB）染色EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。灵敏度为10ng。

4.核酸的紫外吸收

嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。pH7.01.变性（denaturation）定义：

高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成单链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。变性不涉及共价键的断裂。（二）核酸的变性、复性与杂交StagesinthereversibledenaturationandrenaturationofDNA.DNA的稀盐溶液加热到80-100ºC，即可发生热变性。变性在一个较窄的温度范围内“爆发式”发生。

热变性

熔点（熔解温度，Tm）

DNA双螺旋结构失去一半时的温度。一般在82-95℃之间。2.复性（renaturation）

定义：

在一定条件下，变性DNA两条彼此分开的单链重新缔合成双螺旋结构，这个过程称为复性。退火（annealing）

热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程称为退火。StepsinthethermaldenaturationandrenaturationofDNA.3.杂交（hybridization）定义：相同或不同来源的两条单链DNA分子，或单链DNA与RNA分子，如果在某些区域具互补序列，则复性时根据碱基互补原则，可形成DNA-DNA或DNA-RNA杂交分子。Principleofhybridizationtest.核酸杂交可在液相或固相进行。印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

分子杂交（印迹法）的类型

SouthernNorthernWestern（免疫印迹）Eastern待测样品DNARNA蛋白质（单向电泳分离）蛋白质（双向电泳或IEF分离）探针DNARNADNARNA抗体抗体

Southern印迹法（Southernblotting）DNA限制片段限制性内切酶带有DNA片段的凝胶琼脂糖凝胶电泳碱液浸泡凝胶上DNA变性变性的单链DNA转移并牢固结合在硝酸纤维素薄膜上放射性标记探针杂交DNA-DNA(或RNA)杂交分子放射自显影显示出杂交分子的位置中和,转移,烘烤IllustrationofSouthernblotting.(三)核酸的凝胶电泳凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。

核酸分子因带电量、分子量、构象不同，泳动速度不同。带电量越大，分子量越小，泳动速度越快。泳动速度：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA琼脂糖凝胶电泳：

以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳。适于分离0.2~20Kb的DNA片段。凝胶浓度0.5~3%（常用1%胶分离DNA）。应用：分离纯化DNA。确定DNA片段的大小和含量。研究DNA分子的构象。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

以聚丙烯酰胺为支持物。常用垂直板电泳。适于分离10~1000bp的DNA片段和RNA。凝胶浓度3~20%。（四）DNA限制性内切酶的应用

限制性内切酶（restrictionendonuclease）1.定义：2.特点：专一性强（识别序列具特殊的回文结构）切割后的DNA片段具粘末端或平末端是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切断DNA双链的核酸内切酶。3.应用：DNA体外重组的重要工具酶制作DNA限制酶图谱ForeignDNAsequencescanbeinsertedintoplasmidvectorsbyopeningthecircularplasmidwitharestrictionendonuclease.ForeignDNAPlasmidvectorDNA限制酶图谱（restrictionmap）定义：DNA限制酶切片段沿DNA或DNA片段的依次排列。RestrictionmapoftheplasmidpBR322.（五）DNA聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）定义：体外快速扩增DNA的方法。DNA双链经高温变性，分开的单连DNA分别与寡聚核苷酸引物互补结合（退火），在聚合酶、dNTP和Mg2+的存在下，DNA聚合酶催化DNA链的合成，如此经变性-退火-合成三步反复循环，使所需要的DNA片段得到特异的扩增。IllustrationofPCR.①高温变性②低温退火③合成PCR的应用：

基因的分离和克隆基因探针的制备

cDNA文库的构建基因突变的分析和定点诱变酶及辅因子酶的概念与特点酶的化学本质与组成酶的分类酶的底物专一性酶的作用机制酶促反应动力学维生素与辅酶酶（enzyme）活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂。

酶促反应：酶所催化的反应。一、酶的概念与特点

酶与一般催化剂的共同点1.用量少而催化效率高2.可加快化学反应速率，但不改变反应的平衡常数3.可降低反应的活化能SubstrateProductTransitionstate活化能：在一定温度下，一摩尔底物全部进入活化态所需的自由能。

酶作为生物催化剂的特点1.酶易失活：要求温和的条件，如常温、中性pH。2.催化效率高：比一般催化剂高107~1013倍。3.酶具有高度专一性

(specificity)4.酶活力受到调节控制别构调节、共价修饰调控、酶原的激活二、酶的化学本质与组成

酶的化学本质：除核酶外，绝大多数酶是蛋白质。

酶的化学组成

单纯酶：仅含酶蛋白

结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子辅酶：与酶松弛结合，可用透析除去,辅基：与酶牢固结合，透析不易除去。小分子有机化合物：NAD(P)+,FMN,FAD,CoASH等作用：作为电子、原子或某些化学基团的载体。金属离子：Zn2+、Mn2+

、Fe2+、Mg2+等作用：有些为酶活性中心的组分；稳定酶的空间构象

酶的辅助因子与酶结合紧密程度成分：三、酶的分类六大类型：氧化还原酶类（Oxido-reductases）转移酶类（Transferases）水解酶类（Hydrolases）裂合酶类（Lyases）异构酶类（Isomerases）合成酶类（Synthatases,连接酶类Ligases）四、酶的底物专一性(specificity)

定义：指酶对它所作用的底物有严格的选择性。一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性族专一性键专一性旋光异构专一性几何异构专一性类型淀粉酶-D-葡萄糖苷酶L-氨基酸氧化酶琥珀酸脱氢酶酯酶关于酶作用专一性的假说“锁钥学说”（lockandkeytheory）

1894，Fisher“诱导契合”学说（induced-fithypothesis）

1958，Koshland

当底物与酶分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构象发生有利于底物结合的变化。酶与底物在此基础上互补契合进行反应。五、酶的作用机制（一）酶的必需基团与活性中心必需基团:2.活性中心（活性部位）activecenter（site）

指与酶活性有关的基团。常见的有Ser–OH,His咪唑基，Asp和Glu-COOH等。

指酶分子中直接和底物结合并和酶的催化作用直接相关的部位。3.必需基团与活性中心的关系必需基团活性中心内必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团结合底物参与催化维持酶的空间结构结合：酶与底物以次级键（H键、盐键、范德华力等）结合。催化：酶催化底物键的断裂和新键的形成4.活性中心的特点：1）活性部位只占酶分子的相当小的部位。2）由少数几个氨基酸残基的侧链基团组成。3）对于结合酶，辅因子往往也是活性中心的组分。4）构成酶活性中心的这些基团在空间上相距很近。酶氨基酸残基数活性部位的氨基酸残基溶菌酶129Asp52,Glu35胰凝乳蛋白酶241His57,Asp102,Ser195羧肽酶307Arg127,Glu270,Tyr248,Arg145，

Zn2+某些酶活性中心的氨基酸残基（二）酶的作用机理

酶反应包括两类：

①电子转移；②电子+质子以及其它基团转移。

与酶的高效率有关的因素邻近与定向效应底物形变与诱导契合共价催化酸碱催化金属离子催化1.邻近与定向效应邻近效应（proximity）指底物分子与酶活性中心的靠近。

定向效应（orientation）指底物的反应基团与酶活性中心的结合和催化基团严格地‘定向’。（靠近）（定向）2.底物的形变(distortion)例：溶菌酶的催化机制含义：

酶使底物敏感键产生“电子张力”或变形，从而促使敏感键更易断裂。D环形变，由椅式构象→半椅式构象ThemechanismforthelysozymereactionD环形变，由椅式构象→半椅式构象，C1,C2,C5,O位于一个平面，O的负电性可稳定C+

。3.共价催化（covalentcatalysis）

指底物与酶生成一个反应活性很高的共价中间物，从而降低反应活化能，使反应加速。包括亲核催化和亲电催化。例：蛋白水解酶类（Ser蛋白酶）对肽键的共价催化自发缓慢快快酰基化酶+4.酸碱催化(acid-basecatalysis)狭义的酸碱催化（specificacid-basecatalysis）

酶活性中心的某些基团可作为质子供体和受体对底物进行酸碱催化。广义的酸碱催化（generalacid-basecatalysis）H+和OH-对反应的催化。

质子受体和供体对反应的催化。Functionalgroupsinvolvedingeneralacid-basecatalysis5.金属离子催化金属离子可提高水的亲核性能金属离子可通过静电作用屏蔽负电荷结合底物使反应定向在氧化还原反应中起到传递电子的作用例：胰凝乳蛋白酶催化反应机制Structureofchymotrypsin(white)inacomplexwitheglinC(blueribbonstructure),atargetprotein.His57（blue）、Asp102（red）

、Ser195（yellow）含241aa,活性中心含His57,Asp102,Ser195(催化三联体)Thecatalytictriad(催化三联体)ofchymotrypsin.①酰化阶段:His57从Ser195上吸收一个H+；Ser195的O-亲核攻击肽键羰基C原子;肽键羧基部分与Ser195共价相连，肽键氨基部分以H键与His57相连（ES）。（Asp102稳定His57正电荷形式）ES肽键断裂，肽键氨基部分从His57获得一个H+，氨基部分释放；肽键羧基部分与Ser195相连，形成酰基化酶。②

脱酰阶段：水分子攻击酰基化酶，His57

吸收一个H+，OH-攻击羰基C；His57供出一个H+给Ser195，释放C末端产物。酶恢复原状。酰基化酶六、酶促反应动力学酶促反应动力学

是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。底物浓度[S]酶浓度[E]温度pH激活剂抑制剂（一）底物浓度[S]对酶反应速率的影响

米氏公式½VmaxKm

：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。单位mol/L或mmol/L。酶的特征常数，表示酶对底物的亲和力米氏曲线米氏常数的求法—双倒数作图法(二)酶浓度对酶反应速率的影响

V∝[E]（三）pH对酶反应速度的影响vpHoptimumpH

最适pH：在某pH下，酶反应速度最大，此pH为酶的最适pH。最适pH不是酶的特征性常数。（四）温度对酶反应速度的影响

vt℃optimumtemperature

最适温度：在某温度下，酶反应速度最大，此温度为酶的最适温度。最适温度不是酶的特征性常数。（五）激活剂对酶反应速度的影响

某些还原剂：GSH、Cys、Vc金属螯合剂

激活剂:凡是能够提高酶活力的物质。

类型：无机离子中等大小的有机分子蛋白质金属离子:无机阴离子:氢离子K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+

等。Cl-等。肠激酶等(六)抑制剂对酶反应速度的影响抑制剂（inhibitor,I）凡使酶的必需基团化学性质发生改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质。有机磷化合物(例DFP)有机汞、有机砷化合物重金属盐烷化试剂氰化物、CO青霉素不可逆抑制剂可逆抑制剂

竞争性抑制非竞争抑制反竞争抑制返回乙酰胆碱酯酶（二异丙基氟磷酸，DFP）竞争性抑制

抑制剂与底物竞争酶的结合部位，当抑制剂与酶结合后，阻止了底物与酶的结合，从而使酶活性下降。琥珀酸脱氢酶例：抑制•竞争性抑制曲线Vmaxv[S]（不变）KmKm

(变大)WithcompetitiveinhibitorNoinhibitorV=Vmax[S]Km(1+[I][Ki])+[S]Km´(表观米式常数)Ki:抑制剂常数VmaxKmV1=)[I][Ki](1++Vmax1[S]11/[S][I]1/v[I][Ki]Km(1+)-1-1/KmNoinhibitorWithcompetitiveinhibitor维生素与辅酶维生素（Vitamin）

维持机体正常生命活动所必需的一类微量有机物质。水溶性维生素脂溶性维生素VA、VD、VE、VKVB族：VC硫辛酸VB1、VB2、VB3（泛酸）、VPP、VB6、生物素、叶酸、VB12（一）VB2（核黄素）78H异咯嗪核糖醇1536249101.化学结构2.辅酶形式：黄素单核苷酸（FMN）

黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）51FMN、FAD是多种氧化还原酶（黄酶）的辅基，作为递H体，参与氧化还原反应。+2H-2HFMN(FAD)FMNH2(FADH2)+2H-2H琥珀酸脱氢酶琥珀酸延胡索酸例：(二)VPP（抗癞皮病维生素）

1.化学结构包括尼克酸（烟酸）、尼克酰胺（烟酰胺）。吡啶尼克酸尼克酰胺（为主）2.辅酶形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，辅酶I）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，辅酶II

）NAD+和

NADP+是递氢体，参与氧化-还原反应。+2H-2H+H+41NAD+(NADP+)+2H-2HNADH(NADPH)+H+异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸异柠檬酸例：（三）泛酸（VB3,遍多酸）

1.化学结构泛解酸泛酸HOH-Ala2.辅酶形式：辅酶A（

CoASH）辅酶A（CoASH

）是酰基载体。

辅酶A（CoASH）作为酰基载体，在糖、脂、氨基酸代谢中发挥重要作用。糖丙酮酸脂肪酸氨基酸乙酰CoATCA胆固醇酮体CO2+H2O

+能量糖代谢生物氧化

有机分子在机体内氧化分解为CO2、H2O并释放能量的过程。

生物氧化的特点

-细胞内，酶催化进行

-逐步氧化，分次放能

-ATP是能量转运站糖脂类蛋白质含羧基的化合物转变脱羧作用CO2生物氧化中CO2的生成丙酮酸乙醛丙酮酸脱羧酶直接脱羧作用例如：乙酰CoA丙酮酸脱氢酶系丙酮酸氧化脱羧作用：脱羧伴随脱氢（氧化）NADH呼吸链①和FADH2

呼吸链②①大多数底物MH2NAD+FMN[Fe-S]CoQ2H（如:琥珀酸、脂酰CoA等)②某些底物[Fe-S]FAD2Hb[Fe-S]C1Caa3½O2O2-2eH2O2H+复合物Ⅰ复合物Ⅱ复合物Ⅲ复合物Ⅳ生物氧化中H2O的生成例：底物水平磷酸化ATP的生成1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸激酶+ADP+ATPM

2HM2H½O2H2OETCADP+PiATP+H2O能量释放能量生命活动氧化磷酸化偶联氧化磷酸化MH2

NAD+

FMN

CoQ

b

c1

c

aa3

O2FAD

琥珀酸等大多数底物ⅠⅡⅢ

ADP+PiATPADP+PiATPADP+PiATP呼吸链中ATP生成的部位氧化磷酸化的偶联机理化学渗透学说分解代谢合成代谢糖代谢酵解三羧酸循环磷酸戊糖途径乙醛酸途径糖醛酸途径糖原异生作用淀粉、糖原的合成一、多糖和低聚糖的降解乳糖半乳糖蔗糖果糖(G)葡萄糖淀粉唾液-淀粉酶麦芽糖酶

-糊精酶动物体内糖的消化、吸收、转运和贮存肝糖元20%80%血液循环（G,F,Gal等）吸收血液循环单糖肝G单糖转化作用身体各部分利用贮存肌肉：肌糖元脂肪细胞糖原的酶促降解磷酸化酶转移酶去分支酶G-1-P（90%）（10%）G-6-P二、糖的无氧酵解酵解（glycolysis）：无氧条件下，酶将葡萄糖分解为乳酸,并释放ATP的过程。G丙酮酸乳酸乙醛乙醇糖酵解生醇发酵

部位：细胞质步骤：10前5：准备阶段G

(2)3-磷酸甘油醛后5：贮能阶段(2)3-磷酸甘油醛

(2)

丙酮酸

（一）酵解途径（Embden-Meyerhofparnas,EMP）

准备阶段：前5步葡萄糖（G）

（2）3-磷酸甘油醛☆消耗2个ATP1GG-6-P己糖激酶不可逆反应G-6-PF-6-P磷酸葡萄糖异构酶2F–6-PF-1,6-2P

磷酸果糖激酶3不可逆反应4F-1,6-2P3-P-甘油醛磷酸二羟丙酮醛缩酶磷酸二羟丙酮3-P-甘油醛5磷酸二羟丙酮3-P-甘油醛磷酸丙糖异构酶3-P-甘油醛磷酸二羟丙酮贮能阶段：后5步（2）3-磷酸甘油醛

（2）丙酮酸☆生成2NADH(H)+4ATP63-P-甘油醛1，3-2P-甘油酸3-P-甘油醛脱氢酶71，3-2P-甘油酸3-P-甘油酸磷酸甘油酸激酶

底物水平磷酸化3-P-甘油酸2-P-甘油酸磷酸甘油酸变位酶82-P-甘油酸9磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）烯醇化酶10磷酸烯醇式丙酮酸

丙酮酸丙酮酸激酶底物水平磷酸化,不可逆反应互变底物水平磷酸化总反应式：

G+2NAD++2ADP+2Pi

2丙酮酸+2NADH(H+)+2ATP+2H2O

整个酵解过程具三步不可逆反应：

1、3、