投喂方式对麻痹性贝毒在菲律宾蛤仔体内累积与排泄过程的影响

投喂方式对麻痹性贝毒在菲律宾蛤仔体内累积与排泄过程的影响

20世纪以来，有毒红芽藻频繁出现，红芽毒素污染严重，对世界经济和公共卫生有重大威胁。我国的舟山海域在2002年、2006年分别爆发了大规模的有毒藻种亚历山大藻和米氏凯伦藻赤潮,2005年5月24日到6月1日,长江口外海域发生赤潮,最大面积约7000km2,主要赤潮生物为米氏凯伦藻和具齿原甲藻,同年6月2到10日,渤海湾发生赤潮,最大面积约3000km2,主要赤潮生物为裸甲藻和棕囊藻,2006年10月22日到11月5日,河北省黄骅附近海域发生赤潮,最大面积约1600km2,主要赤潮生物为球形棕囊藻[中国海洋灾害公报(2005,2006)],导致生态系统遭到严重破坏。海洋中有毒藻类爆发性增殖会通过在鱼、虾、贝类等海洋生物体内的蓄积会产生一些有毒的活性高分子化合物即海洋生物毒素(marinetoxins),其中,目前危害较大的是贝毒素。在所有海产品中毒事件中,麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)被公认为对公众的健康危害最严重,它大多来源于有毒甲藻,主要是通过食用贝类滤食累积威胁人类的健康与生命安全。近来的研究表明这类毒素在全球的分布越来越广。在我国沿海海域的一些地区也发现了PSP毒素污染的贝类样品。不同贝类对麻痹性贝毒的敏感性、累积能力和排出情况各不相同,从根本上说是由不同贝类对毒素代谢和累积机制的差异所决定的。之前已有人对贝类毒素和累积排出效应进行了研究,但均采用间隔投喂一定量毒藻的实验方式。而在自然海区中,一段时间内藻细胞的数量是稳定的,不会产生大幅度的变化波动,所以室内实验的定期投喂模式与实际状况是有差别的。本实验选择了青岛本地养殖量较大的栉孔扇贝和菲律宾蛤仔为研究对象,设计了一种连续投喂的方式,使水环境中藻细胞数量保持基本恒定,以期研究这两种不同的投喂方式对PSP毒素在栉孔扇贝和菲律宾蛤仔体内累积与排出过程的影响。贝毒的检测方法多样,例如通过小鼠法、酶联免疫检测法等对贝毒进行检验分析,本实验采用的检测方法是目前应用比较广泛,灵敏度较高的高效液相色谱法(HPLC)。1材料和方法1.1实验藻种与培养栉孔扇贝(Chlamysfarreri)于2008年10月5日采于青岛沙子口,洗干净表面,选出个体大小相近的(壳高为2cm左右)置于20L海水(未经过滤)中实验室驯化两天,适量通气,每日投喂一次无毒小角毛藻。菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinesis)于2008年10月5日采于青岛红岛养殖区,洗干净表面,选出个体大小相近的置于20L海水(未经过滤)中实验室驯化两天,适量通气,每日投喂一次无毒小角毛藻。实验藻种微小亚历山大藻(Alexandriumminutum)和小角毛藻(Chaetocerosminutissimus)均引自台湾大学,由国家海洋局第一海洋研究所生态中心实验室培养,实验海水取自青岛石老人海区,使用前经沉淀沙滤,孔径0.45μm醋酸纤维滤膜过滤后备用。实验藻种微小亚历山大藻实验室内单种培养。采用去Si的f/2培养液,所用过滤海水加去离子水稀释至盐度为15～17。培养温度22℃,光照强度为3000lx,培养于80L玻璃缸中,光源为日光灯管,光照周期为L∶D=12h∶12h。小角毛藻采用加Si的f/2培养液,其他条件同微小亚历山大藻。1.2肝胰腺砂仔1最适实验容器为塑料箱,每箱20L海水,实验起始时,每组扇贝90只,蛤仔100只。实验分为两组,以不同的投喂方式投喂藻液,一组每天定期投喂一定量藻液,另一组用连续投喂装置投喂藻液,装置如图1,保证藻液连续性的流入装有贝的容器,并且保持容器内水量恒定。1.2.1投喂量和投喂密度实验操作共进行10d,取静止期的微小亚历山大藻,藻细胞密度约为1.0×105/mL。定期投喂组每日同一时间投喂2L藻液,连续投喂组控制藻液的流量以保证每天投喂与定期投喂组等量藻液。实验过程中随贝数量的减少相应减少所投喂的藻量和更换水的体积。定期投喂组每次投藻后混合均匀,同时以不同方向小气流充气使细胞悬浮。连续投喂装置的流出口固定在实验箱的正上方,箱的四方分别均匀充气,并且装有藻液的容器也要小气流充气,以尽量保证滴入的藻细胞和容器内的藻细胞悬浮并且混合均匀。每隔一天测定藻密度,控制每天投喂的藻细胞数量,使之相对恒定。第一天取扇贝3只、蛤仔5只作为本底对照,然后每隔一天取扇贝3只、蛤仔5只,放入-20℃冰箱中冷冻保存。1.2.2小角毛藻藻投喂累积实验结束后开始排出实验,共进行10d。停止投喂微小亚历山大藻后,改投喂等量无毒的小角毛藻。每隔一天取贝样,方法与累积实验时相同。1.2.3毒副反应及分析样品前处理:把冷冻的贝样化冻,取出贝肉,吸干表面水分,称重,按1∶2(W:V)的比例加入0.03mol/L的HAc与贝肉用匀浆机匀浆,静置萃取。把研磨液装于7mL离心管中,13000r/min离心15min,用注射器抽取上清,然后经0.22μm滤膜过滤注入7mL离心管中冷冻待HPLC分析。毒素分析所用化学试剂均为HPLC级或分析纯,实验用水为经Millipore纯水系统净化后的高纯水。使用仪器为美国Waters公司生产的高效液相色谱仪。分析中使用的毒素标准(包括STX,neoSTX,dcSTX,GTX1,GTX4,GTX2,GTX3,dcGTX2,dcGTX3)购自加拿大国家海洋研究中心。方法根据Marc(2006)所建立的梯度洗脱方法略作修改。2结果与讨论2.1小球藻总毒性pgeq/table实验采用的产毒藻为静止期的微小亚历山大藻,经测定,PSP毒素的总含量为44.41fmol/cell,毒素组分分别为GTX1、GTX2、GTX3、GTX4(膝沟藻毒素1-4),其中GTX1和GTX4的含量较高,分别为19.43fmol/cell和21.32fmol/cell,占总毒性的91.8%,是最主要的组成部分。微小亚历山大藻毒性是14.6pgSTXeq/cell。在扇贝累积实验阶段,投喂微小亚历山大藻的细胞总数为2.0×108/d,换算成毒性大小,平均每只贝的投喂量为29.20μgSTXeq/(ind·d),累积投喂量为292μgSTXeq/ind,实验过程中连续投喂组达到得最高PSP累积量为48.91μgSTXeq/ind,定期投喂组达到41.06μgSTXeq/ind,得出累积率分别为16.74%和14.06%。在蛤仔累积实验阶段,亚历山大藻的投喂量与扇贝实验一致,连续投喂组达到的最高PSP累积量为0.03μgSTXeq/ind,定期投喂组为0.85μgSTXeq/ind,得出累积率分别为0.01%和0.29%。2.2不同投喂方式对私家车用中pc毒素累积的影响在实验前,扇贝本底中检测出了少量PSP,蛤仔本底未检出PSP。累积实验共持续10d。扇贝体内连续投喂组的PSP毒性含量略高于定期投喂组,在累积阶段毒性均随着时间的延长逐渐增加,在累积的最后一天连续投喂组毒性水平达到430μgSTXeq/100g,定期投喂组达到380μgSTXeq/100g,在投喂毒藻的第二天两组实验中PSP毒性水平均超过了贝类食用卫生安全标准(80μgSTXeq/100g),分别为225μgSTXeq/100g和156μgSTXeq/100g。排出过程中毒性随时间延长而逐渐降低,单因素方差分析(ANOVA)不同投喂方式组间PSP毒素累积差异显著,如图2。累积实验共持续10d,两种投喂方式在蛤仔体内产生的PSP毒性随时间逐渐增加,定期投喂组的毒性高于连续投喂组。停止投喂毒藻后毒性开始下降,但连续投喂组的毒素累积量远低于定期投喂组,实验达到的最高累积量仅有32μgSTXeq/100g,定期投喂组的为45.56μgSTXeq/100g,单因素方差分析(ANOVA)不同投喂方式组间PSP毒素累积差异显著,如图3。不同投喂方式下PSP毒素在栉孔扇贝体内的累积存在差异,连续投喂组累积的量要略高于定期投喂组。这可能是由于扇贝长时间处于含低密度毒藻的水体中,扇贝对毒藻不产生生理抑制的原因,藻细胞易被摄食,毒素则易被累积在体内,并且水体中也一直存在可摄取的藻细胞。而定期投喂高浓度的毒藻会使扇贝在一定程度和一段时间上对毒藻产生生理抑制,并且会较快速地把体内的藻细胞重新代谢进水体,因此定期投喂组的扇贝体内毒素含量低于连续投喂组,两种投喂方式下毒素在扇贝体内累积的毒性水平差异显著。但毒藻对贝的摄食抑制是短期的,扇贝对毒藻有一定的适应性,长期存在于这样的环境中会降低贝类对毒藻的“生理不适应”,从而使其摄食抑制减弱而累积毒素的能力提高。不同的投喂方式对PSP毒素在菲律宾蛤仔体内累积的影响差异显著,连续投喂组的毒素累积量低于定期投喂组。菲律宾蛤仔为快速排出贝类,对毒素较敏感,不易累积。连续投喂组中蛤仔处于低浓度毒藻环境中,摄入的毒藻累积在体内后很快会被代谢入水体或把毒素排出体外,水体中的毒素又随水流流出培养箱,所以蛤仔可以把体内的毒素含量维持在一个较低的水平。定期投喂组由于一次性投喂大量的毒藻蛤仔会出现暂时性的生理抑制,不过一段时间内毒藻会一直存在于水体中,由于没有同时投喂饵料藻,经过生理抑制期后蛤仔会被迫食用毒藻,并且摄食后又代谢入水体的藻细胞或毒素可能存在被蛤仔重新吸收的过程,使得定期投喂的蛤仔体内会累积较高含量的贝毒,高于连续投喂组。通过图2与图3的比较看,栉孔扇贝相对于菲律宾蛤仔对PSP毒素的累积能力强,在连续投喂毒藻的第二天毒素累积量就已超过了贝类禁止食用的卫生标准(80μgSTXeq/100g),达到了225.99μgSTXeq/100g,定期投喂的扇贝在本实验累积时间内毒性累积最高达到430μgSTXeq/100g,而定期投喂的蛤仔仅为45.56μgSTXeq/100g,远低于扇贝。此外,连续投喂与定期投喂方式下扇贝对PSP的累积率分别为16.74%和14.06%,分别是蛤仔的1674倍和48倍。连续投喂组扇贝的毒性高于定期投喂组,而连续投喂组蛤仔的毒性远远低于定期投喂组的毒性,结果与扇贝的相反,这可能与种间差异有关。朱明远等研究发现栉孔扇贝摄食微小亚历山大藻48h后内脏中毒素累积就高达5000μgSTXeq/100g。此外,Bricelj等曾对紫贻贝进行了PSP毒素的累积研究,他们选择了一种高毒性的A.fundyense(strainGT429),毒性为66pgSTXeq/cell,高于本实验藻株的毒性。紫贻贝暴露12～13d时毒素含量会达到最高(4.5×104μgSTXeq/100g),若暴露于高密度的这种藻细胞中1h,贝体内的毒性水平就会超过贝类的安全食用标准(80μgSTXeq/100g)。可见,双壳贝类摄食的有毒藻的毒性大小、有毒藻密度和摄食时间与贝类累积后的毒性水平有直接关系,但贝类本身的特性也决定着毒素在贝体内的累积状况。2.3不同投喂方式对贝液毒素含量的影响在扇贝中检测出6种PSP毒素,分别为GTX1,2,3,4和dcGTX2,3,经检测所投喂的微小亚历山大藻中仅含有GTX1,2,3,4四种毒素,所以dcGTX2,3应该是由这四种毒素转化而来的。从图4、5可以看出GTX4在扇贝体内累积的比例最高,连续投喂组中平均达到91.46%,定期投喂组中平均达到72.36%,而藻液中测定的GTX4占毒素总量的比例为48.01%,低于两种投喂方式下扇贝体内GTX4的比例。经单因素方差分析(ANOVA),两组中GTX4占总毒素含量的比例差异不显著,所以不同投喂方式对GTX4在扇贝体内的累积影响不大。在连续投喂组扇贝体内GTX1平均比例为1.44%,定期投喂组的平均比例为9.22%,远低于GTX1在藻液中的含量43.75%,因此不同投喂方式对GTX1累积影响也不大。在连续投喂组扇贝体内GTX2的平均比例为5.05%,定期投喂组的平均为2.44%,在藻液中含量为7.97%,连续投喂组和定期投喂组的平均比例均略低于藻液。在连续投喂组扇贝体内的GTX3平均比例为0.56%,定期投喂组的GTX3平均比例为1.85%,在藻液中的含量为0.29%,连续投喂组和定期投喂组的平均比例均高于藻液中含量(见图4、5)dcGTX2含量在连续投喂组占的平均比例为1.41%,定期投喂组的平均比例为6.34%,dcGTX3的含量在连续投喂组占的平均比例为0.08%,定期投喂组的平均比例为0.10%。结果表明,不同投喂方式下栉孔扇贝对GTX4的累积能力高于GTX1,是扇贝体内主要毒素种类。其中连续投喂方式下差异更明显,说明这种方式可能会促进扇贝对GTX4的快速累积。在排出过程中不同种类毒素比例变化不大,但定期投喂组在排出过程中毒素比例有一定变化。连续投喂组对GTX2,3的累积能力与定期投喂组有一定的差异。连续投喂组中GTX4的平均比例略高于定期投喂组,而其他毒素的平均比例定期投喂组要高于连续投喂组。定期投喂组在排出阶段毒素比例波动较大,GTX1,2和dcGTX2比例有较大增加,见图6。产生这些差别的原因可能是由于扇贝体内毒素的种类发生了复杂的化学转化。Oshima在进行PSP毒素的研究时发现,贝体内的毒素存在着相互转化。大致为C1、C2可转化为B1、GTX3;GTX2可转化为GTX3、STX;NEO可转化为STX;dcSTX可由B1和STX转化而来,GTX1,4可由C3、C4转化而来。本实验扇贝只检测出GTX1-4和dcGTX2,3,未检测出STX。扇贝除了能够将毒藻含有的PSP直接累积在体内,也可以通过体内的酶对不同种类的毒素进行转化。实验中测出的dcGTX2,3是微小亚历山大藻本身不含有的PSP种类,可能是由GTX2,3转化来,不过在本底中检测出了GTX4和dcGTX2,所以dcGTX2的存在也可能是因为实验用的扇贝以前曾经接触过毒藻,但不能排除由其他种类转化而来的可能。蛤仔累积的PSP毒素比例与扇贝比较有一定差别。蛤仔的连续投喂组被检测出的毒素主要为GTX2,GTX4、GTX1和GTX3仅在个别贝中被检测到,定期投喂组被检出的种类主要为GTX2和GTX1,与扇贝不同的是蛤蜊体内未检出dcGTX2,3,在扇贝体内累积率较高的GTX4检出量也很低,很多样品未检测出。结果表明蛤仔对于GTX4累积能力不强,本身不促进或很少促进GTX2,3向dcGTX2,3的转化。从不同投喂方式间比较来看,连续投喂组的蛤仔大多只检测出了GTX2,定期投喂组GTX1、GTX3的含量增高,表明