微生物相关介绍及与车间生产的关系

微生物介绍及制药车间对微生物的防护联邦制药中山分公司十一车间Contents微生物概论1微生物生长所需的营养条件2制药车间生产对微生物的要求3微生物的抑制及灭菌方法4第一章微生物概论什么是微生物？微生物指所有形体微小，单细胞或结构简单的多细胞，或没有细胞结构的一群最低等生物。微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品和药品等物质发生不良变化,造成损失。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产药品，奶酪，泡菜，啤酒和葡萄酒等。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000倍才能看到。比方中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。

1.微生物分类:1.1非细胞类微生物

病毒、类病毒、拟病毒等HIV病毒1.2原核细胞类微生物细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等大肠杆菌放线菌此“细菌〞非彼“细菌〞，我们平时所说的细菌是对微生物的统称。1.3真核细胞类微生物

酵母菌和霉菌，单细胞藻类、原生动物等酵母菌霉菌分生孢子2.微生物特点微生物分布广种类多体积小繁殖快易变异代谢强2.1种类多微生物的种数类型低限倾向种数高限病毒与立克次氏体1,2171,2171,217支原体424242细菌与放线菌>1,0001,5001,500蓝细菌1,2271,5001,500藻类15,05123,10023,100真菌37,17547,30068,939原生动物24,06824,06830,000总数79,78098,727127,298微生物种类繁多,至少有十万种以上。人类已经开发利用的微生物那么仅占已发现微生物种的约1%。局部微生物对人类生存生产有利，局部有害。2.2分布广在空气、水、土壤和动植物体表体内,到处都充满了大量的各种微生物。人体体表及体内存在大量的微生物：☆皮肤外表——平均10万个细菌/平方厘米；☆口腔——细菌种类超过500种；☆肠道——微生物总量达100万亿；

微生物在土壤中的数量最多，据统计，一克土壤中含有几千万到几百亿的微生物。万米深海、85公里高空、地层下128米和427米沉积岩中都发现有微生物存在。2.3体积小病毒——﹤0.2

m杆状细菌——0.5×2.0

m支原体立克次氏体衣原体｝0.2～0.5

m放线菌——菌丝直径0.5×2.0

m霉菌——菌丝直径2～10

m酵母——1-5×5-30

m采用过滤除菌的过滤器的孔径应为d≤0.22μm。

2.4繁殖快★

一般细菌的传代时间为几十分钟至一百多分钟。☆在最适宜的培养条件下,大肠杆菌每13～20分钟就可分裂出新的一代。☆在液体培养基中，细菌细胞的浓度一般为108-109个/ml。★微生物繁殖速度快的特性,在发酵工业上有着重要的实践意义。☆实现发酵工业的短周期、高效率生产。例如生产鲜酵母时，几乎12小时就可以收获一次，每年可以收获数百次。微生物繁殖快，杂菌会迅速造成污染。2.5代谢强★一接种环的谷氨酸生产菌，经两天的扩大培养和发酵就能将8吨糖和2吨尿素转化为3吨菌体和4吨谷氨酸。★一个能够利用乳糖的细菌每小时能消耗〔分解〕的乳糖量等于其自身细胞重量的2千倍以上。★1公斤的酵母菌在一天之内可使几吨糖全部转化为酒精和二氧化碳。代谢能力强的主要原因是由于个体小，比外表积大，因此它们能够在细胞与环境之间迅速交换营养物质和代谢产物2.6易变异★突变频率一般为10-5～10-10★微生物易变异原因：☆个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构易受到外界物理或化学因素影响。☆细胞增殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代。生产青霉素的产黄青霉菌,开始筛选获得时，每毫升发酵液仅含约20单位的青霉素,但经过屡次诱变选育后，每毫升已超过5万单位了。实例病原微生物对抗生素的耐药性变异，40年代初至今，成人患者的青霉素注射剂量,已由每天10万单位提高到100万单位甚至上千万单位。第二章微生物生长所需的营养条件微生物的营养要求？微生物生长繁殖所需的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。〔车间禁带食物进入的原因之一是减少微生物生长的营养物质存在〕水：水是微生物最根本的组成分〔70％—90％〕水是微生物体内和体外的溶剂水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定〔保持车间枯燥可以抑制微生物的生长〕碳源：碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。整体上看来，微生物可以利用的碳源范围极广，从大类上说，可以分为有机碳源和无机碳源两大类，凡必须利用有机碳源的微生物就是异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物就是自养微生物。(糖类是被最广泛利用的碳源)氮源：氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。与碳源相似，微生物作为一个整体来说，能利用的碳源种类十分广泛。某些微生物〔如固氮菌〕能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。多数致病菌那么必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。无机盐类：无机盐主要可为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素。微生物需要的无机盐类很多，主要有P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe等，其主要功能为构成菌体成分；调节渗透压；作为某些酶的成分，并能激活酶的活性等。生长因子：一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量缺乏以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，那么细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个根本相似的子细胞，子细胞又重复以上过程。在单细胞微生物中，由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖。在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。微生物生长空间〔无处不在〕水体空气土壤土壤具有微生物生命活动所必需的一切营养物质和适宜的生活条件，土壤中的水分是一种浓度很稀的盐类溶液，其中含有各种有机和无机氮素及各种盐类、微量元素、维生素等，类似于常用的液体培养基。水具有微生物生命活动适宜的温度、PH、氧气等。水中生长着众多的微生物类群，它们主要来源土壤、空气、动植物尸体、人和动物的排泻物、工业及生活污水。空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘，这类微生物大多数是腐生性的，还来源于人和动物，它们大多数是通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。第三章制药车间生产对微生物的要求十一车间属于无菌车间，生产无菌药品无菌药品的普遍定义是要求没有活体微生物的存在，为了到达产品中没有活体微生物，无菌药品在制造过程中需要采取各种方法来去除制品中原有的微生物和防止制品受到微生物的污染。无菌产品具有几个特殊的性质，如无菌、无热原、无不溶性微粒及高纯度的质量。然而，一个无菌产品生产的最终目标是绝对没有微生物的污染，和其它制剂的标准不同，无菌的标准是一个绝对值。无菌生产的特殊性无菌生产的工艺过程中，产品、容器和密封零件需分别经过灭菌后再进行灌封，由于产品装入最终容器后不能够再对其作进一步的灭菌处理，因此产品的无菌容器在高质量环境下进行灌装和密封的效果就成为至关重要环节。生产制造环境的温度、相对湿度、操作人员的无菌操作习惯等，这些使无菌制造工艺生产的最终产品难以获得高度的无菌保证。再如，在无菌灌装前，最终产品的各个组成局部都已经过不同条件的灭菌处理〔如玻璃容器经干热灭菌、胶塞经湿热灭菌、液体经过滤除菌〕，每一工艺处理过程也都经过充分的验证和控制，但仍有可能出现随机的污染过失。另外，无菌制造工艺在灌封前对无菌药品、无菌的容器和无菌的密封件材料所进行的每一步作业都存在着再污染风险，因此对它们应严格小心地予以控制。有利于防止微生物污染的措施3.1

无菌制造系统中工艺平面布置应遵循的原那么无菌制造系统在生产工艺上，应对使用的洁净厂房特别加以布置设计，尤其是应着重考虑洁净工房工艺平面对无菌制造的适用性和可靠性。无论是进行无菌的粉末分装还是无菌的液体分装，都应着重解决工艺平面布置对无菌制造工艺过程的无菌保证度。首先从工房平面的布置上着眼，在厂房设施设计的层面上解决无菌操作过程的无菌保证问题。3.2

无菌制造对工房装修及材料的要求无菌制造系统使用工房的装修，应表达出工房围护结构的空气密封性好，房内无卫生死角，装修材料外表光洁但不反光、耐压力而不起尘、易于清洁、不易发生霉变和长菌、能够适应各种消毒剂和气体灭菌熏蒸的腐蚀和紫外线照射。3.3

无菌制造对生产设备的特殊要求无菌制造工艺对生产设备的要求，主要围绕参与无菌制造的设备会不会对制品产生污染或降低制造系统的无菌保证程度加以考虑。与无菌药品、包装容器和密封零件相接触的设备外表也应是无菌的。为了满足设备的外表处于无菌状态，要求设备的材料能够耐受高温蒸汽或化学气体的消毒处理，而且有可能灭菌蒸汽按照工艺要求使用的是纯蒸汽。3.4

无菌制造对工艺用水的要求使用无菌制造工艺生产的药品大多数为注射用产品。注射用产品需要考虑热原，因而应采用注射用水。注射用水用于配制产品，以及最终洗涤生产中所用的器件和设备。注射用水需极高的纯度、不含内毒素，注射用水规定的合格工作极限为10

CFU／100

ml。通常，注射用水的品质从水的制备、贮存、分配系统和水系统的微生物控制这4个方面的情况加以评价。3.5

无菌制造对空调净化的要求无菌制造环境评价的主要内容之一是空气的质量，主要是制造环境中空气的悬浮粒子含量。空气中悬浮粒子因其可能进入产品造成污染显得非常重要。另一方面，空气中悬浮粒子可能作为微生物的载体，污染制造过程中的无菌产品。因此，减少空气中悬浮粒子的含量和有效地去除已存在的固体微粒子，始终都是制造过程控制的主要内容。大面积的无菌区域内空气的洁净度至少应为1万级，此洁净度下的每立方米空气中含有≥0.5

μm的粒子数应不得超过350

000个，空气中浮游菌的含量应不得超过100

CFU/m3。无菌容器和密封件以及灌装封口作业的局部暴露区域内空气的洁净度应到达100级要求，该洁净度下每立方米空气中含有≥0.5

μm的粒子数应不得过3

500个，空气浮游菌的含量应不得超过5

CFU/m3。3.6

无菌制造对环境卫生的要求无菌制造系统的操作区域还需要对围护结构的墙面、地面、天花板、门窗等环境设施进行卫生处理。通常要求使用多种清洁剂对制造环境进行适当的消毒和灭菌，常用清洁剂有以下3类：〔1〕作为清洗和强烈的杀菌剂〔如胺盐与非离子外表活性剂〕；〔2〕作为清洗和不含杀菌剂〔非离子外表活性剂，无机螯合剂〕；〔3〕作为清洗窗户的清洁剂。这3类清洁剂根据无菌操作区域的不同需要清洁地面时，清洁剂应交替使用。正常生产情况下，无菌操作区的清洁工程根据室内使用的工器具及具体情况而定。清洁次数取决于该区内生产活动情况。由负责微生物控制的专家对清洁次数作出调整。应经常调换新的清洁水。3.7

无菌制造对人员的要求只有经过批准，经过专门培训的人员方可进入无菌操作区内，无论何时均需遵守这个原那么。例如非无菌操作区的人员和外来参观者需进入该操作区时，必须经过有关部门批准。

3.8无菌制造工艺的完整性

⑴无菌制造工艺过程的时效限制，无菌制造工艺过程中，为保证药品质量，必要时应制定每一个生产工序过程完成的时间限度。例如，为防止因生产时间过长导致微生物生长甚至穿透滤膜而污染滤液，应在规定的最长时间限度内完成产品的过滤和分装。

⑵无菌制造过程的控制：为确保无菌制造工艺所生产药品的无菌保证程度，最重要的是采用的灭菌工艺和无菌灌装工艺的完整性。一般除菌过滤器的完整性试验是在生产前，过滤器装配完成并经过灭菌后进行的。更为重要的是，任何用于除菌过滤的过滤器在使用之后一定要再次进行完整性试验，以查明过滤器在过滤过程中是否有渗漏或穿孔。3.9灭菌工艺的可靠性在无菌制造工艺过程中，通常会使用多种灭菌手段来处理不同的制造材料。常见的灭菌工艺有湿热灭菌、干热灭菌、化学液体和气体灭菌、辐射灭菌以及紫外线照射杀菌等。在这些灭菌工艺中，重要的并不在于采用什么灭菌方法对物品进行灭菌，而在于使用的灭菌方法的可靠性。因此，无论采用那一种灭菌方法，都需要对其灭菌效果进行严格确实认。理想的车间生产环境生产车间应力求宽敞､明亮､通风､透气,雨季要尽量减小车间湿度,定期清扫卫生,一句话:尽量减少细菌的生存条件和尽量抑制细菌的繁殖速度。理想，即是无菌！但我们只能做到相对无菌！第四章微生物的抑制及灭菌方法相关概念灭菌：指将待处理体系中的所有微生物包括微生物的孢子等生态形式都完全除去或使之丧失活性的过程；

杀菌：指将待处理体系中的微生物营养体和繁殖体杀死的过程；

消毒：指破坏待处理体系中微生物的过程，但消毒过程一般对微生物孢子无效，消毒不需要杀灭体系中所有微生物，只需要到达预定的处理要求，一般将体系中的致病和条件致病的微生物除去或之丧失活性；

抑菌：抑制微生物生长繁殖的作用，抑制待处理体系中微生物的活性，使之繁殖能力降低或停滞繁殖的过程；

防腐：指采取一定措施防止物品性能因微生物的破坏而下降的过程和技术。灭菌方法干热空气灭菌法是指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大局部药品的灭菌。

在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能到达灭菌的目的。为了保证灭菌效果，一般规定：135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200摄氏度灭菌0.5-1h。

湿热灭菌湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物：③蒸汽存在潜热．当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。为到达良好的灭菌效果，一般要求温度应到达121℃(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。紫外线灭菌 波长在220-300纳米的紫外线称为“杀生命区〞，其中以260纳米的杀菌力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。紫外线透过物质的能力很差，适用于空气及物体外表的灭菌，与被照物的距离以不超过1.2米为宜，照射时间30分钟。紫外灯对皮肤、眼睛会造成一定伤害，因此，使用紫外灯时就加以注意，开传递窗时应注意紫外灯是否已关闭。

化学药剂灭菌⒈75%的酒精酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变性凝固，从而到达杀灭细菌的目的。酒精杀菌消毒能力的强弱与其浓度大小有直接的关系，过高或过低都不行，效果最好的是75%。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，使细菌外表蛋白质首先变性凝固，形成了一层巩固的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。酒精极易挥发，因此，消毒酒精配好后，应立即置于密封性能良好的瓶中密封保存、备用，以免因挥发而降低浓度，影响杀菌效果。

⒉新洁尔灭溶液新洁尔灭属季胺盐类消毒剂，为淡黄色胶状液，易溶于水，呈碱性反响，性质稳定，摇动时有大量泡沫。可用0.1％～0.5％新洁尔灭溶液进行喷洒、浸泡、擦抹等灭菌工作。新洁尔灭消毒液应随用随配。⒊奥星伟士芬溶液使用奥星伟士芬溶液对墙壁等抹拭10分钟后需用同等级别的水擦干净。⒋甲醛熏蒸药厂大型无菌操作，常用甲醛溶液加热熏蒸进行空气灭菌。甲醛气体能使菌体蛋白质变性凝固和溶解菌体类脂，可以杀灭物体外表和空气中的细菌繁殖体、芽胞下真菌和病毒,所以经一定时间后可杀死病原微生物。甲醛气体熏蒸消毒：40%甲醛溶液10ml，为每m3空间的熏蒸量。

按房间由里到外的顺序，房间熏蒸消毒12～24小时。

室温应保持25℃以上，湿度应保持60％以上。熏蒸后应保证洁净区内无甲醛味才可进入工作。

⒌臭氧消毒灭菌臭氧〔O3〕是一种气体强氧化剂，消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气〔O2〕和单个氧原子〔O〕；后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死，多余的氧原子那么会自行重新结合成为普通氧原子〔O2〕，不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂，它不但对各种细菌有极强的杀灭能力，而且对杀死霉素也很有效。我国的药品生产GMP验证中早已推荐了臭氧灭菌方法。臭氧〔O3〕灭菌优势小资料传统灭菌方法的缺陷和臭氧灭菌的特点传