土著细菌D2203对载砷赤铁矿砷迁移转化的影响

土著细菌D2203对载砷赤铁矿砷迁移转化的影响日

土著细菌D2203对载砷赤铁矿砷迁移转化的影响摘要砷对人体健康存在潜在威胁，蓄积在人体内的砷，能对人体的免疫系统、神经系统、呼吸系统等造成不同程度的损伤，一次性摄入大量砷会引发急性中毒，严重时可导致死亡。在砷的生物地球化学循环中，砷代谢微生物对Fe（III）氢氧化物的还原性溶解使得砷从沉积物中释放出来，是形成高砷地下水的一个重要原因。目前有关山西大同盆地中耐砷厌氧土著细菌的相关研究十分有限。研究高砷含水层中耐砷厌氧微生物在地下水中砷的迁移转化中发挥的作用，对丰富砷迁移转化机理的认识有重要意义。本文基于山西大同盆地沉积物中分离的土著细菌来研究其对不同赋存形态As（V）和Fe（III）的还原释放特征，取得以下认识：在无机盐培养基中用不同碳源对土著细菌D2203进行培养，发现选用丙酮酸钠作为碳源最适合D2203的生长，稳定时期的OD值可达到0.30左右。在一定浓度范围内，液相As（V）和Fe（III）以及固相的赤铁矿不会对D2203的生长造成影响。细菌D2203对可以还原液相的As（V）和Fe（III），也可以同时还原赤铁矿的Fe（III）并对释放出的五价砷进行还原，且细菌对载砷赤铁矿的还原可能具有一定的浓度效应。（4）细菌对附砷赤铁矿上砷的释放有明显的促进作用，导致此现象的原因可能是细菌还原并释放赤铁矿中的Fe后，矿物结构发生变化进而导致结合态的五价砷从附砷赤铁矿中脱落下来，进入溶液中的五价砷又进一步被细菌还原。EffectsofnativebacteriaD2203onarsenictransferandtransformationinarsenic-bearinghematiteAbstractArsenicisapotentialthreattohumanhealth.Arsenicaccumulatedinthehumanbodycancausevaryingdegreesofdamagetotheimmunesystem,nervoussystem,respiratorysystemandsoon.Inthebiogeochemicalcycleofarsenic,thereducingdissolutionofFe(III)hydroxidesbyarsenicmetabolizingmicroorganismsresultsinthereleaseofarsenicfromsediments,whichisanimportantreasonfortheformationofhigh-arsenicgroundwater.Atpresent,thereareonlyafewstudiesontheindigenousarsenic-tolerantanaerobicbacteriaindatongbasin,ShanxiProvince.Itisofgreatsignificancetostudytheroleofarsenic-tolerantanaerobicmicroorganismsinhigharsenicaquifersinthetransferandtransformationofarsenicingroundwater.Inthispaper,thereductionandreleasecharacteristicsofAs(V)andFe(III)indifferentformswerestudiedbasedontheindigenousbacteriaisolatedfromthesedimentsofdatongbasininShanxiProvince,andthefollowingunderstandingswereobtained:(1)IndigenousbacteriaD2203wereculturedininorganicsaltmediumwithdifferentcarbonsources,anditwasfoundthatsodiumpyruvatewasselectedasthemostsuitablecarbonsourceforthegrowthofD2203,andODvalueinthestableperiodcouldreachabout0.30.(2)Withinacertainconcentrationrange,hematiteinliquidphaseAs(V),Fe(III)andsolidphasewillnotaffectthegrowthofD2203.(3)BacteriaD2203canreduceAs(V)andFe(III)intheliquidphase,reduceFe(III)inhematiteatthesametimeandreducethereleasedpentavalentarsenic,andbacteriamayhavecertainconcentrationeffectonthereductionofarsenium-bearinghematite.(4)Thebacteriatoattachonarsenichematitehaveobviousroleinpromotingthereleaseofarsenic,thecauseofthisphenomenonmaybebacteria,afterreductionandreleasetheFeinhematitemineralstructurechangesleadingtocombinationstateofpentavalentarsenicfromoffwitharsenicinhematite,intothesolutionofpentavalentarsenicisfurtherreductionbythebacteria.目录TOC\o"1-3"\h\u第一章绪论 绪论1.1选题背景及研究意义砷，作为一种十分常见且毒性较强的致癌物质之一，是一种无处不在的微量元素，并且广泛分布于食物、水、土壤等其他各种自然环境中[1]。砷对人体健康存在潜在威胁，过量的砷会影响细胞的正常代谢，对细胞呼吸和氧化过程造成干扰，致使细胞病变。砷还可对小动脉和毛细血管壁造成损伤，使血管渗透性增加，导致血容量降低，加重对内脏器官的伤害。砷存在于地壳中，含量仅为1.5mg/kg，但容易被释放到环境中。砷从地壳中被释放到环境中的途径主要有两条：一是自发的生物地球化学循环过程，包括雨水侵蚀岩石、微生物砷化合物代谢、火山爆发和森林燃烧等形式。二是人类活动，包括矿产的开采冶炼，含砷农药、杀虫剂、木材防腐剂和涂料的使用，饲料添加剂、制药、玻璃、半导体和电子等工业生产中的使用[2]。砷污染现象在全世界范围都存在，许多国家地下水砷浓度超过了WHO的饮用水标准限定值（10ug/L），据统计全球约有1.4亿人的饮用水受到砷污染[3]。我国砷污染事件始见于20世纪60年代台湾省，目前为止已有多个省市及自治区出现了砷污染和砷中毒事件，特别是近年来，砷污染事件常有发生，给人们的生活带来危害。2007年，贵州独山县某企业违规排污，导致麻球河和都柳江流域中砷含量超标，造成数十人砷中毒，沿河约2万多人生活用水困难[5]。2008年，云南阳宗海发生了严重的砷污染，2.6万人的饮水安全受到威胁，严重危害当地生态系统的安全[6]。饮用高砷地下水是导致慢性砷中毒的主要原因，而中国是遭受慢性砷中毒危害最严重的几个国家之一[7]。根据调查结果显示，在内蒙古高砷饮水型地区地方性砷中毒患病率已达到15.54%[8]。因而各国政府和公众已纷纷开始重视地下水中砷异常以及其引起的环境问题[9]。图1.1中国高砷地下水分布实验表明，好氧土著还原菌能够把As（V）还原为As（III），从而导致砷的释放和迁移。而很少有研究探讨山西大同盆地含水层中的厌氧土著细菌。此外，厌氧土著细菌在砷循环中的作用还不清楚，这值得更多的研究。因此，探究厌氧土著细菌在砷转化和迁移中的作用至关重要。1.2国内外研究现状1.2.1高砷地下水研究现状1.2.1.1地下水中砷的来源和迁移规律环境中的砷来源可分为自然源和人工源[17]。自然源决定了自然界中砷的背景值。天然条件下，砷来源的主要路径是火山喷发、矿物风化、矿物沉积等一系列过程。而地表或者地下水体中比较高浓度的砷通常源自于附近的地质活动或是含砷矿，有些温泉水中的砷浓度能够达到100-5000μg/l[18]。燃煤、冶金、各种固废处理、化工生产以及农业生产活动等人为活动又进一步促进了环境中砷的迁移和释放，砷污染因而加剧，这其中采矿活动的污染造成的危害尤为明显。据统计结果显示，每年进入到环境中的砷，有80%来自于铜矿的冶炼，砷进入环境后通过蒸发、沉积、渗滤等一系列过程致使附近的地下水和土壤被污染。另外，在石油燃烧过程中，烟道内同样会浓缩有毒As4O6，这些气体能够挥发到空气中而造成大气砷污染。因此，工业排放的“三废”也成为水体砷污染的主要途径[19]。图1.2砷在自然界不同环境介质中的循环进行环境中的砷会在大气圈、土壤圈、水圈中形成砷循环，砷在不同的环境介质中迁移并伴随着复杂的形态转化[20]。天然前提下，岩石和沉积物中的砷经过火山爆发、风化作用等活动进入大气中，人为活动如未经处理的含砷矿渣、采矿残留的废石等经过风华作用，砷被排放如大气环境中。大气中的砷经过沉降过程，例如降雪、降水等，降落到地表，砷从而进入水体或者土壤进行再循环，进而完成砷再自然环境介质中一次简化循环。进入水体或土壤固相中的砷，经过各种生物和理化（天然有机质、微生物作用等）作用，最终改变地下水砷的存在形式、赋存和迁移状态。含水介质性质、地下水径流条件、地下水的酸碱度、氧化还原环境等都密切影响地下水中砷的形成和转化过程[21]。地下水的酸碱度：酸碱度对地下水中砷的富集发挥着关键的作用，砷在地下水中的存在形式、砷在沉积物中释放、胶体在含水层中所带的电荷都会受酸碱度的作用，一般来说，pH值越高，地下水中砷浓度也越高。氧化还原环境：氧化还原环境会改变砷在自然环境中的迁移能力和存在形式而影响地下水中的砷迁移、转化和富集[22]。氧化条件下，砷的高价氧化物容易被含水层中的矿物吸附而形成沉淀，使其迁移能力降低；还原条件下，砷主要以不易被吸附的As（III）形式存在，因而迁移能力较强。所以，在氧化环境中，地下水砷含量一般会低于还原环境中的砷含量。另外，地下水中的天然有机质（NOM）会改变氧化还原电位，并通过竞争吸附、形成复合物等作用将滞留在固体中的砷释放入水体，从而导致地下水砷污染[23]。微生物能够通过氧化还原等作用改变含水层中砷的存在形态和电位参数，从而改变砷在水相和固相中的存在比例，最终影响地下水中砷的循环和分布[24]。1.2.1.2山西大同盆地砷污染现状山西大同盆地是中国典型的高砷地下水地区，研究表明：山西大同盆地地区及其周边的地下水砷含量普遍处于较高水平。目前，仅山阴县饮用高砷水的人口约有3.5万，中毒病区涉及20多个乡镇63个村庄，患病人数5087人，患病率达12.05[25]。因此，研究和探讨地下水砷的形成原因和迁移转化规律，对合理开发利用地下水资源和改水防砷具有重大意义。1.2.2厌氧耐砷微生物的研究现状1.2.2.1厌氧微生物耐砷机制和氧化还原过程根据不同的砷代谢机制，这些微生物可大致分为异养型砷氧化菌、化能无机自养型砷氧化菌、异化砷呼吸还原菌、砷抗性微生物和砷甲基化微生物[26]。在砷氧化基因作用下，微生物通过电子呼吸链的传递作用，将三价砷氧化为五价砷的实现过程是砷氧化机制。耐砷还原机制是指通过微生物电子呼吸链传递或者好氧砷还原酶作用，将五价砷还原为三价砷并排出体外的过程。主要存在形式包括异化呼吸还原和好氧还原脱毒两种机制[27]。图1.3耐砷菌耐砷机制的产生过程及产生位置1.2.2.2厌氧耐砷微生物对砷元素迁移转化的影响耐砷细菌能够还原存在或吸附于固体介质上的砷，如无定形氧化铝或氧化铁上的砷，或者含砷矿物如臭葱石中或沉积物中的砷，它将结合态的砷转化为液相中溶解态的砷[28]。研究表明，介质中大量有机物的存在会对耐砷细菌还原结合态砷起到极大地促进作用。另外，作为电子穿梭体的蒽醌-2，6-二磺酸二钠（AQDS），能够通过影响矿物表面Fe（III）的还原，从而加速矿物表面As（V）的还原[29]。可以看出，耐砷细菌对矿物中固体形态砷的还原作用很可能是环境中尤其是地下水体中的砷污染形成的重要因素之一。砷还原微生物能够将胞内或细胞表面溶解态或溶解态的As（V）还原为毒性更强的As（III），As（III）通过释放进入水体，导致土壤含水层或地下水中的As（III）含量的增加，从而加重土壤或水体中的砷污染状态[30]。所以，对砷还原机制的探究能够帮助我们加强对砷迁移转化过程有更全面的了解。1.2.2.3厌氧耐砷微生物对铁元素迁移转化的影响在砷吸附和解吸附作用研究中，有极强的亲和力和丰富的含量的铁（氢）氧化物日渐成为人们研究关注的重点[31]。铁氧化物和砷的相互作用已经有学者进行了一定程度的研究。含铁矿物的氧化还原过程中，砷的迁移转化会直接受到影响，在一定条件下，亲水性的铁（氢）氧化物的溶解或释放会导致原本吸附态和结合态砷的释放。在高浓度As和Fe（III）共存的厌氧地下水中，Fe（III）氢氧化合物的还原性溶解已经被广泛认为是一种砷迁移机制，在这个过程中，Fe（III）还原菌起到决定性作用[32]。铁还原菌会通过还原含砷的铁氢氧化合物从而引起砷的释放。Zobrist等人在2000年的研究中，着重讨论了一株耐砷细菌对附载As（V）的水铁矿上的还原作用，这株菌即可利用As（V）又能利用Fe（III）作为电子受体，讨论了不同的吸附方式对最终As（V)还原速率的影响，以及还原过程中Fe（III）的还原，为孟加拉和印度自然环境中高砷地区砷的迁移转化规律提供了研究依据[33]。1.2.2.4山西大同盆地的耐砷微生物研究现状近年来，针对山西大同盆地高砷地下水的微生物已经有了初步研究。Wang等人在2008年的研究中，通过从山阴县古城采集到的沉积物中分离获得了120株耐砷菌。经PCR-RFLP多态性分析后确定为5种砷还原菌Comamonassp.,Delftiasp.,Kocuriasp.,Stenotrophomonassp.,Thauerasp.，它们对As（III）的耐性都超过了15Mm，是研究新型耐砷分子机理的优势菌株[34]。而本实验则是研究一种新型Bacillussp.对载砷赤铁矿上铁元素和砷元素迁移转化的影响。1.3选题意义对于山西大同盆地高砷地下水，已有研究发现微生物对含水层中砷的迁移转化发挥着重要作用，且有研究表明微生物作用导致的铁，锰，铝等矿物的氧化还原是地下水环境中砷的迁移的主导因素。已有部分研究发现砷、铁以及砷还原菌或铁还原菌共同作用，控制着地下水中砷的存在状态，本文基于山西大同盆地分离的土著砷铁还原菌来研究其对载砷铁矿中砷铁的还原释放，这对于更好的了解山西大同盆地地下水环境中砷的转化有一定的参考意义。1.4研究内容和技术路线1.4.1研究目的越来越多的研究表明，微生物的生物转化对地下水砷的迁移、转化、富集等地球化学作用起至关重要的作用，并且这个问题也受到国内相关领域学者的重视。本实验旨在研究在模拟地下水条件下耐砷微生物对溶解态砷铁的还原以及载砷赤铁矿中砷铁的还原释放。1.4.2研究内容耐砷厌氧微生物在不同碳源上的生长情况：先在LB培养基中对耐砷厌氧微生物进行扩大培养，然后将菌株分别接种至加入不同碳源（乳酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠以及延胡索酸钠）的无机培养基中进行培养，观察菌株生长情况；在砷、铁的作用下菌株的生长情况：采用最佳碳源对菌株进行培养，并在培养基中分别加入一定浓度的砷和铁，观察菌株的生长情况，并与没有加入砷、铁时菌株的生长情况进行对比；菌株对液相砷和液相铁的还原作用：采用最佳碳源对菌株进行培养，并在培养基中分别加入一定浓度的砷和铁，测定系统中砷和铁的形态变化；菌株对载砷赤铁矿中砷铁的还原作用，采用Schwertmann的方法制备赤铁矿，设置不同含量的载砷赤铁矿，测定系统中砷和铁的转化情况。1.4.3技术路线根据研究目的和内容，确定的技术路线入下图所示：图1.4实验技术路线

不同碳源对土著细菌生长情况的影响2.1实验材料与方法2.1.1实验材料与试剂磷酸二氢钾（KH2PO4），氯化钾（KCl），无水氯化钙（CaCl2），氯化钠（NaCl），氯化镁（MgCl2·6H2O），酵母粉，蛋白胨，氯化铵（NH4Cl），乳酸钠（C3H5O3Na），丙酮酸钠，延胡索酸钠，葡萄糖，0.22μm微孔滤膜。2.1.2实验用培养基表2.1实验用培养基配方培养基种类培养基配方基础盐培养基磷酸二氢钾：0.14g/l，氯化钾:0.5g/l，无水氯化钙:0.13g/l，氯化钠:1.00g/l，氯化镁:0.62g/l，酵母粉：0.50g/l，碳源（乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、延胡索酸钠）：20mM/l，氯化铵：0.25g/l。有机培养基酵母粉：5g/l，蛋白胨：10g/l，NaCl:5g/l固体琼脂培养基酵母粉：5g/l，蛋白胨：10g/l，NaCl:5g/l，琼脂粉20g/l2.1.3主要实验仪器与设备表2.2实验仪器名称和型号仪器名称型号生产厂家电子天平TP-602DENVERINSTRISMENT高压灭菌锅LD2X-30KBS上海申安医疗器械厂生化培养箱LRH-250上海一恒科技有限公司厌氧培养箱LAI-3上海龙跃技术有限公司紫外无菌操作台UVC/T-AR上海凌初环保仪器有限公司紫外-可见分光光度计UV1800-PC陕西海联化玻仪器化工有限公司2.1.4实验方法2.1.4.1细菌的扩大培养与纯化取前期从大同盆地高砷地下水沉积物中分离出来的土著细菌D2203接种至有机培养基中扩大培养，培养2到3天后，在紫外无菌操作台上涂平板多次纯化。之后再接种至基础盐培养基中进行下一步实验。2.1.4.2最优碳源的选择配置四组200毫升的基础盐培养基，每组设置三个平行样。分别向每组中加入20mM的乳酸钠，丙酮酸钠，葡萄糖，延胡索酸钠，其中乳酸钠和丙酮酸钠与培养基一起在121摄氏度高压蒸汽灭菌20分钟，葡萄糖和延胡索酸钠通过0.22微米的滤膜过滤灭菌后加入到灭菌后的无机盐培养基中。每次取样操作均在厌氧手套箱中进行，每次取3ml液体于10ml离心管中，待测OD值。然后将各血清瓶封盖后均用parafilm封口膜，密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中，每隔24个小时，取样一次，于紫外-可见分光光度计（λ=600nm）测其OD值并记录下来绘制其生长曲线。实验中所用枪头、离心管等均经过高温灭菌和紫外杀菌，所有的玻璃器皿都用5%的盐酸浸泡超过24小时，再用去离子水冲洗三次晾干备用。2.2结果与讨论从图2-1中可以看出D2203在基础盐培养基的条件下能迅速进入对数期，大概需要1-2d的时间开始进入稳定期，且采用丙酮酸钠作为碳源时D2203的生长情况明显优于其他碳源条件下细菌的生长情况，以丙酮酸钠作为碳源时稳定期的OD值大概在0.27左右，而以乳酸钠、葡萄糖以及延胡索酸钠作为碳源时稳定期的OD值均不超过0.20。图2.1不同碳源下D2203的生长情况2.3本章小结不同碳源对细菌D2203生长情况影响的结论如下：细菌D2203在基础盐培养基中生长可迅速进入对数期，在1-2d左右时间开始逐渐进入稳定期。采用丙酮酸钠作为碳源时细菌的生长情况最好，OD值最高可达到0.28，在后续实验应采用丙酮酸钠作为碳源对细菌进行培养。

As和Fe对土著细菌生长的影响3.1液相As和Fe对土著细菌生长的影响3.1.1实验材料与方法3.1.1.1实验材料与试剂磷酸二氢钾（KH2PO4），氯化钾（KCl），无水氯化钙（CaCl2），氯化钠（NaCl），氯化镁（MgCl2·6H2O），砷酸钠（Na3AsO4·12H2O），酵母粉，蛋白胨，氯化铵（NH4Cl），丙酮酸钠、柠檬酸铁、盐酸（优级纯），HEPES缓冲剂，0.22μm微孔滤膜。3.1.1.2实验仪器与设备表3.1实验仪器名称与型号仪器名称型号生产厂家电子天平TP-602DENVERINSTRISMENT高压灭菌锅LD2X-30KBS上海申安医疗器械厂生化培养箱LRH-250上海一恒科技有限公司厌氧培养箱LAI-3上海龙跃技术有限公司紫外无菌操作台UVC/T-AR上海凌初环保仪器有限公司紫外-可见分光光度计原子荧光分光光度计UV1800-PCAFS-930陕西海联化玻仪器化工有限公司北京吉天仪器有限公司3.1.1.3实验方法配置三组100毫升的基础盐培养基，分别为砷酸钠（Na3AsO4·12H2O）、柠檬酸铁以及空白对照。每组设置三个平行样。向每组加入20mM的丙酮酸钠，加入后将培养基一起在121摄氏度高压蒸汽灭菌20分钟。然后向其中一组培养基中加入0.5mM柠檬酸铁，向另外一组培养基中加入1mg砷酸钠（Na3AsO4·12H2O），剩下一组作为空白对照。再将三组培养基放置再厌氧手套箱中曝气，约30min后将培养至对数期的相同体积的D2203菌液接种至培养基中，封盖后均用parafilm封口膜密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中。每隔一段时间，手动摇匀一次，然后分别于0、24h、48h、72h、96h取样一次，每次取3ml液体于10ml离心管中，将样品于紫外-可见分光光度计（λ=600nm）测其OD值并记录下来绘制其生长曲线。实验中所用枪头、离心管等均经过高温灭菌和紫外杀菌，所有的玻璃器皿都用5%的盐酸浸泡超过24小时，再用去离子水冲洗三次晾干备用。3.1.2结果与讨论从图3-1中可以看出在基础盐培养基中加入砷酸钠和柠檬酸铁D2203的生长情况与普通基础盐培养基中D2203的生长情况基本保持一致。实验证明，在溶液中存在一定浓度内的As和Fe不会对D2203的生长造成影响。图3.1液相As/Fe对D2203生长情况造成的影响3.3本章小结由以上数据可知，As和Fe对细菌D2203生长情况影响的结论如下：溶液中存在一定浓度的As和Fe或者附砷赤铁矿时对细菌D2203的生长不会受到影响；在进行后期细菌还原As、Fe实验时可保证细菌的生长不受到抑制，As、Fe的还原情况可直接反映细菌D2203的还原能力。

土著细菌对As（V）和Fe（III）的还原作用4.1土著细菌对液相As（V）和Fe（III）的还原4.1.1实验材料与方法4.1.1.1实验材料与试剂磷酸二氢钾（KH2PO4），氯化钾（KCl），无水氯化钙（CaCl2），氯化钠（NaCl），氯化镁（MgCl2·6H2O），砷酸钠（Na3AsO4·12H2O），酵母粉，蛋白胨，氯化铵（NH4Cl），丙酮酸钠。活化液（1:1甲醇溶液），SEP强阴离子交换柱，0.22μm微孔滤膜，盐酸（优级纯），抗坏血酸，硫脲，氢氧化钾，硼氢化钾，柠檬酸铁，菲啰嗪，HEPES缓冲剂。4.1.1.2实验仪器与设备表4.1实验仪器名称与型号仪器名称型号生产厂家电子天平TP-602DENVERINSTRISMENT高压灭菌锅LD2X-30KBS上海申安医疗器械厂生化培养箱LRH-250上海一恒科技有限公司厌氧培养箱LAI-3上海龙跃技术有限公司紫外无菌操作台UVC/T-AR上海凌初环保仪器有限公司紫外-可见分光光度计原子荧光分光光度计UV1800-PCAFS-930陕西海联化玻仪器化工有限公司北京吉天仪器有限公司4.1.1.3实验方法（一）培养基的配置配置四组100毫升的基础盐培养基，分别为加入As（V）的接种细菌组及空白对照组和加入Fe（III）的接种细菌组及空白对照组。每组设置三个平行样。向每组加入20mM的丙酮酸钠，加入后将培养基一起在121摄氏度高压蒸汽灭菌20分钟。然后向其中二组培养基中加入0.5mM柠檬酸铁，向另外二组培养基中加入1mg/l砷酸钠（Na3AsO4·12H2O）。再将四组培养基放置在厌氧手套箱中曝气，约30min后将培养至对数期的相同体积的D2203菌液接种至两组接种细菌组的培养基中，剩下2组不接种菌作为空白对照，封盖后均用parafilm封口膜密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中。每隔一段时间，手动摇匀一次，然后分别于0、24h、48h、72h、96h、120h取样一次。（二）取样取样前先对厌氧手套箱进行紫外灭菌，待灭完菌后将培养基放入厌氧手套箱中。取样时从加Fe（III）的接种细菌组及空白对照组中各取1ml菌液加入10ml离心管中，从加As（V）的接种细菌组及空白对照组中各取8ml菌液加入10ml离心管中，取样完成后均用parafilm封口膜密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中。整个取样操作均在厌氧条件下进行。（三）Fe的测定测试方法：Ferrozine法测试原理：亚铁离子在pH4~9之间的溶液中与菲洛嗪生成稳定的紫色络合物。此络合物的可见吸收光谱显示单个尖峰，在波长562nm处具有最大尖峰，在该波长下，其摩尔吸光系数为27900L·mol-1·cm-1。若用还原剂（抗坏血酸）将高铁离子还原，则本法可测高铁离子及总铁含量。测试步骤：先将从培养基中取出的样品稀释5倍，然后取1ml稀释后的菌液与1.5ml菲洛嗪溶液混合，将混合液于紫外-可见分光光度计（λ=562nm）以水为参比测定其吸光度，并作空白校正，记录并计算Fe（Ⅱ）浓度。再取1ml稀释后的菌液与1.5ml加入还原剂（抗坏血酸）的菲洛嗪溶液混合，将混合液静置24h后，待还原剂将溶液中的高铁离子都还原为Fe（Ⅱ）之后于紫外-可见分光光度计（λ=562nm）以水为参比测定其吸光度，并作空白校正，记录并计算总Fe浓度。（四）As的测定测试方法：原子荧光光谱法测试步骤：将装有样品的离心管放置再离心机中，在4000r下离心5min，然后开始使用SEP强阴离子交换柱分离三五价砷，使用之前先用1:1的甲醇活化萃取柱，再用超纯水清洗，取2ml样品溶液过0.22μm的滤膜再将过膜后样品经过活化的阴阳离子交换柱，并且以1～2滴/s速度流出以润洗交换柱。之后取4毫升样品经过同样的操作步骤流出交换柱，此溶液为As(III)；然后取6ml1mol/lHCl溶液清洗阴离子交换柱,此溶液为As(V)，最后对交换柱进行清洗。再通过AFS-930原子荧光光度计测定砷含量。标准曲线的绘制：本实验所用原子荧光光度计可实现在线自动绘制标准曲线，所以配制好砷标准溶液后，直接上机，输入配制浓度和位置号，保证标准曲线R值达到0.999以上。每次测定样品时均须配制标准溶液，并绘制标准曲线。将预处理过的溶液按照AFS-930原子荧光光度计操作要求上机测试。4.1.2结果与讨论从图4-1中可以看出细菌D2203可以把溶解态Fe（III）还原为Fe（Ⅱ），在接种菌的培养基中有90%以上Fe（III）被还原为Fe（Ⅱ），而空白对照组的培养基中几乎没有Fe（Ⅱ），实验证明细菌D2203对Fe有较强的还原能力。除此之外，从图4-1中还能发现Fe（Ⅱ）在1-2d时浓度迅速增加，推测造成此现象的原因可能是在0-1d时细菌刚刚进入对数期迅速生长，而在1d时细菌数量已经处于较高的水平，导致溶液中开始有大量Fe（III）被还原为Fe（Ⅱ），而之后细菌增殖数与死亡数开始趋于平衡，细菌总数不再增加，且溶液中Fe（III）浓度逐渐减少，导致还原速率减慢，最终在4d左右时间Fe（Ⅱ）浓度达到峰值不再增加。图4.1细菌对溶液中Fe的还原情况从图4-2中空白培养基也能将少量的As（V）还原为As（III），大概能将溶液中20%左右的As（V）还原为As（III），而接种菌的培养基可将溶液中约50%的As（V）还原为As（III）。另外，从图中还可发现0-1d时接种菌和空白组的As（V）浓度降低速率几乎一致，证明0-1d时As（V）的还原是由培养基中其他因素造成的，而从1d开始空白组培养基中的As（V）和As（III）浓度几乎保持在一个相对稳定的水平，接种菌组培养基则由于细菌D2203的还原作用As（V）还在继续向As（III）转化，直到第5d时间开始趋于稳定。图4.2细菌对溶液中As的还原情况4.2载砷赤铁矿的合成4.2.1实验材料与方法4.2.1.1实验材料与试剂氢氧化钾（KOH）、硝酸铁（Fe(NO)3·9H2O）、碳酸氢钠（NaHCO3）、聚乙烯瓶、砷酸钠（Na3AsO4·12H2O）4.2.1.2实验仪器与设备表4.1实验仪器名称与型号仪器名称型号生产厂家电子天平TP-602DENVERINSTRISMENT高压灭菌锅X射线衍射仪高速离心机LD2X-30KBSD8-FOCUSHC-2066上海申安医疗器械厂德国Bruker

AXSD8-Focus安徽中科中佳科学仪器有限公司4.2.1.3实验方法提前将500ml蒸馏水和300ml1MKOH放在水浴锅中加热至90℃，将砷酸钠按照As：Fe(摩尔比)=0.05的量加入预热后的500ml蒸馏水中搅拌，之后将40gFe(NO)3·9H2O加入，并立即与300ml1MKOH和50ml1MNaHCO3混合至溶液呈褐色，然后将混合溶液的pH调至8-8.5，将混合液装入聚乙烯瓶中封盖后在90℃水浴中保持48h。将混合液分装至25ml离心管中于7000r下离心10min，取沉淀部分装入培养皿中烘干成矿。待赤铁矿完全风干后采用粉末压片法,用BrukerAXSD8-FocusX射线衍射仪进行XRD（X晶体衍射）测试。图4.3载砷赤铁矿XRD图谱4.2.2结果与讨论由图可以看出，赤铁矿的XRD图谱出现了三个明显的尖锐衍射峰，赤铁矿在不同2θ值处分别出现了3.6869、2.7043、2.5153、2.2093、1.8430、1.6980、1.4887的尖锐峰，根据与JointCommittee关于粉末衍射的XRD标准赤铁矿卡片对比，可以看出自制赤铁矿的XRD图谱中均为赤铁矿的特征衍射峰。4.3土著细菌对固相As（V）和Fe（III）的还原4.3.1实验材料与方法4.3.1.1实验材料与试剂赤铁矿，磷酸二氢钾（KH2PO4），氯化钾（KCl），无水氯化钙（CaCl2），氯化钠（NaCl），氯化镁（MgCl2·6H2O），砷酸钠（Na3AsO4·12H2O），酵母粉，蛋白胨，氯化铵（NH4Cl），丙酮酸钠，活化液（1:1甲醇溶液），SPE强阴离子交换柱、0.22μm微孔滤膜，盐酸（优级纯），抗坏血酸，硫脲，氢氧化钾，硼氢化钾，柠檬酸铁，菲啰嗪，HEPES缓冲剂。4.3.1.2实验仪器与设备同表4-1。4.3.1.3实验方法（一）培养基的配置用3.2.1.3制备的载砷赤铁矿按0.5g/l和1.0g/l的浓度进行实验，赤铁矿使用之前在灭菌锅中以90摄氏度灭菌六小时，最后加入灭菌冷却之后的培养基中。配置四组200ml的无机盐培养基，每组设置三个平行样，分别为加入0.5g/l载砷赤铁矿的接种细菌组和空白对照组以及加入1.0g/l载砷赤铁矿的接种细菌组和空白对照组。待冷却至室温后，在厌氧条件下，分别接种相同体积的培养至对数期的D2203菌液于培养基中，封盖后均用parafilm封口膜密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中。每隔一段时间，手动摇匀一次，然后分别于0、24h、48h、72h、120h、168h、216h取样一次。取样取样前先对厌氧手套箱进行紫外灭菌，待灭完菌后将培养基放入厌氧手套箱中静置一段时间，待赤铁矿基本沉淀到瓶底时再开始取样，取样时从加Fe（III）的接种细菌组及空白对照组中各取1ml菌液（上清液）加入10ml离心管中，从加As（V）的接种细菌组及空白对照组中各取8ml菌液（上清液）加入10ml离心管中，取样完成后均用parafilm封口膜密封瓶盖与瓶颈处，将密封后的血清瓶摇匀，置于32℃培养箱中。整个取样操作均在厌氧条件下进行。Fe的测定和As的测定同4.1.1.3。4.3.2结果与讨论从图4-3中可发现，在实验1-3d过程中，无论是空白组还是接种菌组培养基中的As（III）和As（V）浓度都在增加，说明赤铁矿加入培养基中即使不加菌也会有部分溶解导致As（V）的释放。但接种菌组的As（III）增长速率明显要大于空白对照组，说明细菌D2203对赤铁矿中砷的释放是有促进作用的。图中接种菌组的As（V）浓度增长较为缓慢，这可能是因为部分As（V）刚被赤铁矿释放便被细菌还原成为了As（III），也可能是伴随着赤铁矿的还原，赤铁矿上丰富的表面位点再次吸附了As（V）。在低浓度实验中接种菌的培养基中As（III）大约占总砷的63.2%，As（V）占大约占总砷的36.8%。图4.4低浓度固相实验细菌对砷的还原作用从图4-4中可看出，相比于低浓度实验，高浓度实验中接种菌组的三价砷和五价砷要明显高于空白对照中的As（III）和（V），可见细菌对载砷赤铁矿的还原具有一定的浓度效应。在高浓度实验中接种菌组的As（III）大约占总砷的55.7%，As（V）大约占总砷的44.3%。图4.5高浓度固相实验细菌对砷的还原作用从图4-5中可发现，空白对照组培养基中的空白总铁浓度在1-5d时也会呈现出上升趋势，但二价铁始终保持在很低的水平，证明赤铁矿本身在培养基中有一定的溶解度，而没有接种细菌的空白对照组溶解的Fe基本以Fe（III）形式存在，因此溶解的Fe基本以Fe（III）形式存在。而接种菌组的二价铁和总铁浓度变化曲线在1-3d时几近重合，说明这段时间细菌几乎把溶液中的Fe都还原成了Fe（II），而到最后趋于稳定时总Fe浓度比Fe（II）浓度略高，Fe（II）大概占总Fe含量的80.0%，证明细菌对Fe有很强的还原能力。图4.6低浓度固相实验细菌对铁的还原作用而图4-6中曲线的大致变化趋势与图4-5保持一致，不同的是高浓度实验中最后Fe（II）大约占总Fe含量的57.1%，相比于低浓度实验Fe（II）占总Fe的比例有明显下降，推测原因可能是细菌在一定浓度范围内对Fe有着较强的还原能力，或者说细菌只能还原一定量的Fe的量，随着浓度的增长，溶液中Fe（II）所占比例会逐渐下降至50%左右趋于稳定。图4.7高浓度固相实验细菌对铁的还原作用4.3本章小结（1）细菌D2203在适宜的条件下可以还原液相的Fe（III）和As（V），且无论是对Fe的还原速率还是还原比例都要大于As，由此可推断细菌D2203对Fe（III）的还原能力强于对As（V）的还原能力；（2）细菌D2203对Fe的还原能力可能受浓度影响，低浓度时溶液中80%以上的Fe以Fe（II）形式存在，而高浓度时溶液中的Fe只有57.1%时以Fe（II）存在，表明高浓度的赤铁矿对细菌对赤铁矿的还原具有一定的抑制作用；（3）细菌可以同时还原赤铁矿上的As和Fe，对附砷赤铁矿上As的释放有明显的促进作用，导致此现象的原因可能是细菌对赤铁矿的还原性溶解，以及对还原铁矿物后释放出的五价砷的还原。

结论与展望5.1主要结论从大同盆地浅层高砷地下水沉积物中筛选的土著耐砷细菌D2203，在无机盐培养基中选用丙酮酸钠作为碳源最适合D2203的生长，稳定时期的OD值可达到0.30左右。实验浓度下的液相As（V）和Fe（III）以及固相的赤铁矿都不会对D2203的生长造成影响。细菌D2203对可以还原液相的As（V）和Fe（III），也可以同时还原赤铁矿的Fe（III）并对释放出的五价砷进行还原，液相实验中，溶液中90%以上的Fe都被细菌还原成了Fe（II），50%左右的As（V）被细菌还原成了As（III）；而固相实验中，在低浓度实验中Fe的还原率也接近于90%，但高浓度实验中Fe的还原率只有57.1%。；另外低浓度实验中As的还原率为63.2%，而高浓度实验中As的还原率为55.7%。因此推断细菌对载砷赤铁矿的还原具有一定的浓度效应。在固相实验中，细菌D2203对Fe的还原能力可能受浓度影响，在一定范围内，浓度越高还原率越低，说明高浓度的赤铁矿对细菌的功能造成了影响或者降低了细菌的活性。细菌对附砷赤铁矿上砷的释放有明显的促进作用，导致此现象的原因可能是细菌还原并释放赤铁矿中的Fe后，矿物结构发生变化进而导致结合态的五价砷从附砷赤铁矿中脱落下来，进入溶液中的五价砷又进一步被细菌还原。5.2后期展望本次实验在探究液相As和Fe对细菌生长造成的影响时只设置了一个浓度，确认了本次实验过程所使用的As、Fe浓度不会对细菌生长造成干扰，后期应设置一系列浓度梯度，进一步探究不同浓度下As和Fe对细菌生长造成的影响；由于赤铁矿本身的颜色对固相实验中测定细菌的生长造成了影响，进而本实验中没有关于附砷赤铁矿条件下细菌的生长情况，之后应采用平板计数法对固相实验中的细菌进行计数，明确细菌的生长情况；探究细菌促进附砷赤铁矿上砷释放的具体原因，进一步探究载砷铁氧化物矿物在微生物的作用下，铁矿物的转化过程和机理，以充分理解砷在铁氧化物矿物的还原性溶解过程中的迁移转化规律。

致谢转眼四年的大学学习生活即将划上一个句号，而于我的人生来说却仅仅只是一个逗号，我将面对新的征程新的开始。这四年的大学生活不仅使我的知识结构上了一个新台阶，更重要的是各方面素质也得到了提高。而这一切都要归功于我的老师和师兄师姐以及同学们的热心帮助。在此我首先要向我的导师谢作明老师表达深深的敬意和感谢，谢老师为人谦和，平易近人。也许我不是您最出色的学生，但您却是我最尊敬的老师，您用心为我营造一种良好的学术氛围，让我在科研过程中学会更加严谨，您严谨的治学之风将影响和激励我的一生。还要感谢我的师姐陈梦娜，从论文的选题、实验的设计和进行以及论文的完成，她都悉心竭力的为我提供指导和帮助，除此之外还抽出时间对我的论文进行不厌其烦的修改，字字句句把关，提出许多中肯的指导意见，没有她就没有我这篇论文的最终完成，在此向其致以十二分诚挚的谢意！另外也要感谢王佳、王晶、巨凡凡、赵欣鑫、高班、杨洋、方军华等师兄师姐在实验过程中给予我的指导。感谢我的大学同学、室友四年以来的关照，感谢你们给予我的所有关心和帮忙。同窗之谊，终身难忘！最后，感谢家人一直以来对我学业的支持、鼓励，对我生活上的关心和照顾。焉得谖草，言树之背。养育之恩，无以为报。你们永远健康快乐是我最大的心愿！

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