对羟基苯甲醇抗血小板聚集作用及机制研究

对羟基苯甲醇抗血小板聚集作用及机制研究

苯甲醇是科兰科植物天麻的主要化学成分之一。课题组前期的研究表明,天麻具有较强的抗血小板聚集活性［1］,但其活性成分尚不十分清楚。随后从天麻乙酸乙酯提取部位分离纯化得到一组脂溶性酚性成分,对该组成分进行抗血小板聚集活性筛选后显示,对羟基苯甲醇为主要活性成分之一。本文对对羟基苯甲醇的体外、体内抗血小板聚集活性进行了研究,并初步探讨其作用机制。1实验试剂和仪器1.1药物与试剂对羟基苯甲醇购自Sigma,批号:MKBG4937V,纯度99%;花生四烯酸(ArachidonicAcid,AA)购自日本TCI(批号:A0781);二磷酸腺苷(ADP)购自Sigma(批号:091M7002V);阿司匹林购自Sigma(批号:129K5400V);Fura2-AM购自Sigm(批号:010M1351);TritonX-100购自MPBiomedical,LLC(批号MR28831);EGTA购自BIOBASICINC(批号:MC1027B4010J);吐温-80,国药集团化学试剂有限公司(批号:090711);水合氯醛(分析纯),天津市瑞金特化学品有限公司(批号:20090814);枸橼酸钠:(批号:A20120416)。1.2仪器LBY-NJ2四通道血小板聚集仪(北京普利生科贸集团);酶标仪(infiniteM200PRO);赛多利斯XS125A分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);IISS-1B数字式超级恒温浴槽(成都仪器厂);台式低速离心机(上海电机厂)。1.3动物日本大耳白兔,体质量2~2.5kg,雌雄兼用,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合格证号:SCXK(川)2008-24。清洁级雄性SD大鼠,体质量250~300g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合格证号:SCXK(川)2008-24。2血小板聚集活性测定2.1体外血小板聚集实验用10%的水合氯醛3ml·kg-1的剂量腹腔注射麻醉家兔,自颈总动脉取血,收集于一次性塑料试管中,采用3.2%枸橼酸钠抗凝,取血时试管内枸橼酸钠与取血量的比例为1∶9,取后立即颠倒混匀。血液于室温以1000r/min离心10min得到上层液即富血小板血浆(plateletrichplasma,PRP),取上清液后余下以3000r/min离心10min得贫血小板血浆(plateletpoorplasma,PPP),用比浊法进行血小板聚集性测定,记录血小板聚集率,并以公式[(对照管聚集率-样品管聚集率)/对照管聚集率×100%]计算药物对血小板聚集的抑制率。2.3血小板细胞钙离子浓度([Ca2+]i)测定(双波长荧光分光光度法)［5］2.3.1样品制备同上得到家兔PRP,以3000r/min离心15min后弃上清液,沉淀下来的血小板用无钙HEPES缓冲液洗涤2次后,用无钙HEPES缓冲液调血小板数400×109·L－1,加入Fura-2/AM,37℃恒温避光振摇负载。2.3.2双波长Fura-2荧光分光光度计法测定血小板胞外钙内流﹑细胞内钙释放在上述HEPES液中加入CaCl2溶液孵育10min,调血小板数400×109·L－1,取含Ca2+的HEPES细胞重悬液加入药物,37℃孵育5min(或取无Ca2+的HEPES细胞重悬液加入药物,37℃孵育5min),测定荧光值。用酶标仪测定荧光强度,Em为505nm,Ex分别为340、380nm,双波长下得荧光比值(F)。使细胞静息1min后加AA,5min后加0.1%TritonX-100破坏其细胞膜,测饱和状态下得最大荧光比值(Fmax),最后加入EGTA络合钙离子,测得最小荧光比值(Fmin)。按公式［5，6］:[Ca2+]i=kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Ff2/Fb2)计算家兔血小板细胞在有无外钙下AA诱导的血小板[Ca2+]i。2.4统计方法实验结果数据以ue003±s表示,以SPSS12.0进行统计学分析。组间比较用q-检验,Logit法计算IC50。3对羟基苯甲醇的影响3.1对羟基苯甲醇对AA﹑ADP诱导的家兔体外血小板聚集的影响结果显示,对羟基苯甲醇(0.4,0.2,0.1g·L－1)对AA的家兔体外血小板均有抑制作用,IC50为0.107g·L－1,与溶媒对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);对羟基苯甲醇(0.4,0.2g·L－1)对ADP诱导的家兔体外血小板聚集均有抑制作用,IC50为0.3g·L－1。与溶媒对照组比较差异有统计学意义(分别为P<0.01,P<0.05)。见表1。3.2对羟基苯甲醇对大鼠下腔静脉血栓形成的影响结果显示,对羟基苯甲醇高﹑中﹑低剂量均能显著减轻血栓湿重,对抗大鼠静脉血栓形成。见表2。3.3对羟基苯甲醇对血小板细胞[Ca2+]i的影响结果显示,对羟基苯甲醇(0.4,0.1g·L－1)对AA诱导的家兔血小板细胞外钙内流与内钙释放和溶媒对照组相比差异均有非常显著性意义(P<0.01),与阳性药物组比较对羟基苯甲醇(0.4,0.1g·L－1)对AA诱导的家兔血小板细胞内钙释放相比差异有显著性意义(P<0.01,P<0.05)。表3。4对羟基苯甲醇的作用机理血小板的活化﹑聚集是动脉粥样硬化、心肌梗死、中风等多种心脑血管疾病的重要发病机制之一,因此,研究药物抗血小板活化聚集的作用,对于防治相关疾病以及开发新药至关重要［7］。课题组前期的研究提示,从天麻乙酸乙酯部位中利用化学分离结合活性筛选的方法得出的三种化合物具有显著的抗血小板聚集作用,其中对羟基苯甲醇抗AA诱导的家兔体外血小板聚集作用选择性更强,然而迄今为止关于其抗血小板聚集的作用及机制的研究报道较少。花生四烯酸(AA)作为一种诱导剂主要依赖于磷脂酶A2(PLA2)信号系统,利用COX和血栓素合成酶产生血小板的诱导剂血栓素A2(TXA2),血栓烷A2的生理活性是诱导血小板聚集和降低血小板cAMP水平［8］。而Ca2+能促进磷脂酶A2的活化,从而导致TXA2的生成以及血小板的释放反应,进而引起血小板活化聚集。本研究结果显示,对羟基苯甲醇在体内、体外均有抗血小板聚集活性,且其作用具有选择性对抗AA途径的血小板聚集的特点;在对抗大鼠下腔静脉血栓形成方面,同等剂量(20mg·kg－1)情况下,对羟基苯甲醇的作用强度与阳性对照药阿司匹林相当(P>0.05)。对羟基苯甲醇对内钙释放和外钙内流均具有显著的作用,由此认为对羟基苯甲醇抑制AA诱导的血小板聚集的机制可能是通过抑制细胞膜上钙离子通道,使钙离子内流受阻,即其通过抑制钙离子内流发挥抑制血小板聚集的作用;也可能通过抑制磷脂酶A2的活性,从而减少TXA2的生成以及血小板的释放反应达到抑制血小板聚集的作用。2.2体内血小板聚集实验取清洁级雄性SD大鼠,体质量250~300g,随机分为5组,即模型组、阳性对照组(阿司匹林)、天麻成分B低剂量组、天麻成分B中剂量组、天麻成分B高剂量组,每组8~9只。大鼠连续给药3d,模型组给予溶媒(1%吐温-