自体外周血干细胞移植糖尿病下肢缺血患者下肢肌肉内的骨骼肌重建

自体外周血干细胞移植糖尿病下肢缺血患者下肢肌肉内的骨骼肌重建

0糖尿病下肢活检细胞治疗糖尿病下肢缺血性疾病是指糖尿病发展和治疗中下肢动脉狭窄引起的慢性下肢缺氧。传统药物治疗效果很低。一些患者的长期治疗效果不理想，尤其是下肢动脉流出道关闭，缺乏代谢支。使用任何药物都很难将血管连接起来。随着干细胞基础研究和临床应用的进展,为糖尿病下肢缺血患者提供了一个新的治疗手段,将干细胞移植到糖尿病下肢缺血患者的下肢肌肉内后,在缺血缺氧环境下诱导生成血管内皮细胞、表皮细胞等,形成新生毛细血管、再生表皮,逐渐分化并形成新的毛细血管,达到促进血管再生,改善和恢复糖尿病下肢缺血患者的患肢血流;但采集外周血或骨髓干细胞风险较大,对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高;糖尿病下肢缺血患者多为年龄偏大的老年患者,考虑其自体干细胞数量、分化能力下降,且糖尿病患者外周血中内皮祖细胞不仅数量减少,而且增殖潜能、黏附和成血管能力均降低。与骨髓和自体外周血干细胞相比,脐带资源丰富,间充质干细胞更原始,扩增能力更强,诱导分化后可获得足量干细胞且向血管、骨、肌肉、神经分化能力更强大,具有更加有效的干细胞潜能,且细胞采集简单,以容易获得、免疫原性弱。本实验利用糖尿病兔动物模型,观察人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,HUCMSCs)移植对糖尿病兔缺血下肢血管再生的作用。1人带间充质干细胞移植设计:自身对照动物实验。时间及地点:实验于2009-12/2010-03在解放军第463医院血液内分泌科实验室完成。材料:实验动物:健康日本大耳白兔20只,雌雄各半,体质量2.0~2.8kg,六七个月龄,空腹血糖均低于10mmol/L。购自解放军沈阳军区总医院动物实验中心。实验方法:动物模型的制备:(1)糖尿病兔模型的建立:用灭菌后的称量皿精确称取四氧嘧啶0.60~0.80g,临用前2min加无菌生理盐水12~16mL配成0.05g/mL四氧嘧啶生理盐水液,四氧嘧啶给药剂量为115mg/kg;按不同剂量及体质量计算出每只兔所需0.05g/mL四氧嘧啶生理盐水的体积,将四氧嘧啶经耳缘静脉在30s内注射完毕,监测血糖,专人守护48h防止严重低血糖发生,观察血、尿指标变化;注射四氧嘧啶后48,72h随机血糖(上海强生血糖仪)大于11.1mmol/L确定为糖尿病。(2)下肢缺血模型的建立:成模72h后将糖尿病兔模型给予氯胺酮联合氟哌利多麻醉后,自两侧腹股沟韧带至膝关节上下做一纵行切口行股动脉及其分支分离术,分别结扎并离断股动脉及分支。每只兔左后肢为人脐带间充质干细胞移植组;右后肢为对照组,即注射生理盐水组。人脐带间充质干细胞悬液制备:(1)脐带的收集:无菌条件下,收集足月顺产或剖腹产健康产妇的脐带(均为非乙肝、丙肝、艾滋病及梅毒螺旋体抗体阳性者),4℃保存,6h内处理。(2)脐带的前期处理:在超净台内将脐带充分洗涤,冲去脐静脉及动脉内的残存血并剔除动静脉血管。将脐带剪成长度1.0cm小段,经匀浆处理至1mm×1mm大小后移至0.1%胶原酶Ⅳ中,置于37℃恒温振荡器内,持续消化1.0~1.5h,再加入0.25%的胰酶,37℃振荡消化10min左右,用80~100目滤网过滤,去除未消化的组织。将含细胞的滤液进行离心洗涤2次。(3)细胞分离和培养:将洗涤后的细胞接种于含有UltraCULTURE培养液的75cm2塑料培养瓶中。放置于37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。三四天后,更换培养基,去掉未贴壁细胞,至细胞长到80%~90%融合时进行传代培养。人脐带间充质干细胞免疫表型分析(analyzedhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsimmunitysurfacetype):(1)取第3代脐带间充质干细胞在显微镜下观察。(2)应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达CD105、CD90、CD73、CD44,不表达CD34,CD45,证实为脐带间充质干细胞。见图1,2。最后所获间充质干细胞制备成1×107L-1细胞悬液5mL待用。人脐带间充质干细胞移植:糖尿病兔双下肢缺血模型成模3d后,用1mL注射器将干细胞悬液分15点(每点平均细胞数约为1.67×106L-1)注射于每只兔左后肢内收肌和腓肠肌内;用1mL注射器将5mL生理盐水分15点注射于每只兔右后肢内收肌和腓肠肌内。皮温测定:于造模前、造模后及干细胞移植后第2~30天,每天用红外线皮温仪(PIC2-POLO多功能红外线体温仪,瑞士)测定兔双后肢皮温变化。苏木精-伊红染色:将实验兔充分麻醉后,分别于干细胞移植术后第2,4周取双侧后肢内收肌和腓肠肌标本3~5块,冰冻切片甲醇固定,苏木精染色5min,盐酸乙醇分化后反蓝15min,伊红染色3min,经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封固。光镜下对照观察双侧血管分布密度。免疫组织化学染色测定毛细血管密度:干细胞移植术后第2,4周取双侧后肢内收肌和腓肠肌标本3~5块,采用SP法,实验步骤按照试剂盒说明书进行,冰冻切片7µm,一抗用博奥森公司CD31抗体,DAB显色,PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。统计学分析:测定数据应用SPSS13.0软件包分析,以表示,采用配对t检验和秩和检验分析。2结果2.1动物的数量分析2.2两组皮温的比较,见表1移植后第15天和第30天移植组皮温为(36.900±1.745)℃,(37.200±1.770)℃,明显高于对照组皮温(35.800±1.755)℃,差异有显著性意义(P≤0.05)。2.3血管内皮细胞cd1图1免疫荧光染色:对照组未见到经DIL染料免疫阳性的干细胞,见图3;移植组肌间质出现大量经DIL染料免疫荧光染色阳性的干细胞,见图4。苏木精-伊红染色:对照组可见少量毛细血管,见图5;移植组有大量毛细血管出现,较对照组毛细血管数明显增多,见图6。免疫组化染色:血管内皮细胞CD31阳性,呈棕黄色染色。对照组可见少量毛细血管,见图7;移植组可见大量毛细血管,较对照组明显增多,见图8。细胞移植后2,4周,实验组新生毛细血管数目均明显多于对照组(P<0.01),见表1。3患者治疗糖尿病下肢活检的效果随着干细胞基础研究和临床应用的进展,为糖尿病下肢缺血患者提供了一个新的治疗手段,将自体骨髓或外周血干细胞移植到糖尿病下肢缺血患者的下肢肌肉内后,在缺血缺氧环境下诱导生成血管内皮细胞、表皮细胞等,形成新生毛细血管、再生表皮,逐渐分化并形成新的毛细血管,达到促进血管再生,改善和恢复糖尿病下肢缺血患者的患肢血流,从而提高糖尿病下肢缺血的皮肤温度,缓解下肢疼痛及冷、凉感觉,溃疡面缩小或愈合。但对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高;糖尿病下肢缺血患者多为年龄偏大的老年患者,考虑其自体干细胞数量、分化能力下降,且糖尿病患者外周血中内皮祖细胞不仅数量减少,而且增殖潜能、黏附和成血管能力均降低;使用其自体或骨髓干细胞移植方式,担心效果不够理想。而脐带中含有丰富的间充质干细胞及造血干细胞,与骨髓和自体外周血干细胞相比,脐带资源丰富,间充质干细胞更原始,分化扩增能力更强,诱导分化后获得足量干细胞且向血管、骨、肌肉、神经分化能力更强大,具有更加有效的干细胞潜能,且细胞采集简单,以容易获得、免疫原性弱。本实验将人脐带间充质干细胞移植到缺血缺氧的糖尿病兔肢体肌肉中,在荧光镜下观察,显示