lr在天然免疫应答中的作用

lr在天然免疫应答中的作用

登革病毒（dv）感染可导致登甲热（df）、登甲出血热（dhf）和登甲休克综合征（dnss）等疾病。这是热带地区最重要的蚊传播业务疾病。在亚洲和南美洲地区,高频率流行且有生命威胁的DHF/DSS呈持续扩张趋势。据世界卫生组织(WHO)估计,登革热的流行范围在最近50年至少扩大了30倍。每年全世界感染登革热的人数达1000万例,发生DHF/DSS的有50万例,其中25000例死亡,主要发生在15岁以下儿童。登革热的传播媒介是伊蚊,分布于全球。目前登革热在我国南方沿海各省市仍有暴发流行。对于登革病毒引起的感染,目前仍无特异性治疗药物。在感染早期判断登革病毒的复制强度有助于临床结果[从发烧性疾病(DF)至生命威胁性疾病(DHF)]的判断。理解机体天然免疫对登革病毒感染的影响有重要意义。1结构域与登革病毒的关系登革病毒微粒由外层糖蛋白和病毒衣壳蛋白包裹基因组构成,和其他正链RNA病毒一样在敏感细胞内进行复制。病毒进入细胞期间,经网络蛋白介导内吞作用发生内化,激发病毒外层糖蛋白结构重排,释放病毒RNA进入胞质。正链RNA被翻译为一个多聚蛋白,即衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A/B、NS3、NS4A/B、NS5)。E蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个结构域,其中结构域Ⅲ涉及病毒与细胞受体之间的相互作用,而结构域Ⅰ、Ⅱ则与登革病毒的致病机制相关。本课题组曾成功克隆上述3个结构域,研究显示结构域Ⅲ具有阻断登革病毒的作用。哺乳类细胞的许多蛋白,包括DC-SIGN37/67kD(dendriticcell-specificICAM-3grabbingnonintegrin37/67kD)、高亲和性层黏连受体(lamininreceptor)葡萄糖调节蛋白(GRP)78、热休克蛋白(HP)70和90、CD14相关蛋白、甘露糖受体等已被建议作为登革病毒的受体蛋白。Sakuntabhai等2009年调查了泰国三家医院的606例登革病毒感染患者,并以696名健康人作为对照,发现DC-SIGN1-336启动子基因变异与DHF的发生密切相关,检验该基因的变异对于预防和治疗DHF有重要价值。本课题组曾鉴定了一个哺乳类BHK-21细胞所编码的35kD蛋白分子,推测为登革病毒的受体蛋白,有关其抗登革病毒的效应及相关特征正在鉴定。我们还将白纹伊蚊幼虫、蛹、雄蚊、雌蚊总蛋白分别经病毒覆盖亲和层析实验,筛选出分子量为35kD、45kD的两个有价值的登革病毒连接分子,发现35kD的登革病毒连接分子分别出现在白纹伊蚊幼虫、蛹、雌蚊,而雄蚊无这一分子。雄蚊不吸血也不传病,雌蚊吸血并传病,提示白纹伊蚊35kD登革病毒连接分子具有登革病毒组织向性,在病毒与宿主细胞的相互作用方面扮演着重要角色。2反应：邓革命病毒的自然免疫细胞2.1人类免疫细胞中的免疫反应快速启动宿主的天然防御机制有助于在早期限制登革病毒的感染。鉴定在登革病毒感染早期的关键抗病毒天然免疫细胞,仍是揭示DF发病机制最为重要的问题之一。树突细胞(dendriticcells,DCs)作为部分未分化的免疫细胞分布于全身各类组织,优先占据着病原体可能入侵的位点,在机体的天然免疫和被动免疫中扮演着关键角色。人类DCs按其组织分布分为3类:(1)淋巴样组织DCs,包括并指状树突细胞(interdigitatingDCs)和胸腺DCs;(2)非淋巴样组织DCs,包括郎格汉斯细胞(LC)和间质DCs;(3)循环DCs,包括外周血DCs和隐蔽细胞。未成熟的树突细胞感知微环境并捕捉抗原,但并不能有效呈递抗原至T细胞。类浆细胞DCs(pDCs)和血液-前体骨髓样DCs在抗病毒的天然免疫中发挥Th1适应性(adpative)免疫应答作用。NK细胞则通过分泌干扰素γ(IFN-γ)活化巨噬细胞和DCs,参与天然免疫应答。2.2免疫靶细胞不同最近的观点认为单核-巨噬细胞是登革病毒感染的最初靶细胞。当蚊叮吸人血时,蚊接种登革病毒进入人类皮肤,其潜在靶细胞是表皮/间隙DCs,如位于上皮细胞内的LC。Wu等和Palucka等对鼠或猴进行皮下DV-2注射,结果显示可于24h内引起表皮LC高度活化并迁移,提示LCs是登革病毒感染的免疫靶细胞。单核细胞-衍生DCs(MDDCs,类似于间质DCs)也是登革病毒感染的靶细胞。与单核细胞或巨噬细胞相比,体外产生的未成熟MDDCs更易被登革病毒感染。为了评估登革病毒感染期间DCs的数量,一些研究者在DF患者中完成了一项系统的纵向研究,发现在登革热早期,循环性前-成熟DC(circulatingpre-mDC)的频率和绝对数降低伴随着登革病情严重性的增加,另一方面,普通登革热患儿发病早期pDCs频率上升的同时循环性pDCs绝对数保持稳定,而发展为登革出血热儿童的发病早期,其循环性pDCs水平降低。3ifn和ifn抗病毒天然免疫应答的另一个关键方面,是合成和分泌Ⅰ型干扰素(IFN)如IFN-α和IFN-β,发挥抗病毒与免疫调节功能。此过程需要激发有效的抗病毒天然免疫应答,包括:(1)通过免疫系统受体探测入侵病毒;(2)启动蛋白信号激酶调节合成IFNs。3.1i织物的结构及其与ifn的关联Ⅰ型IFNs包括多个IFN-α亚型和1个IFN-β亚型。在应答病毒攻击时,在IFN-β启动子位置会组装形成一个多蛋白复合体,称为增强子。该增强子至少由3类转录因子组成,即ATF-2/c-Jun,核因子(NF)-κB以及干扰素调节因子3(IRF3)。上述3类转录因子通过其亚细胞位置来调节NF-κB和IRF-3的活性。在无活性状态时,通过抑制性κB(IκB)家族成员将NF-κB阻断于胞液内。在受到不同刺激时,IκB激酶(IKK)磷酸化,IκB泛素化,随后蛋白酶体分解,释放NF-κB移位至核,启动靶基因转录。与NF-κB相似,无活性形式的IRF3在应答病毒攻击时,由IKK类似激酶TBK-1和IKKε磷酸化IRF3,而磷酸化的IRF3导致其形成二聚体并移位至细胞核[16,17,18,19,20,21,22]。此外,IFN-β连接于IFN-α/β受体(IFNAR),通过自分泌和旁分泌方式启动正反馈环,导致I型IFNs的进一步产生。IFNARs激发Janus激酶JAK家族成员JAK1和Tyk-2的活化,并依次活化转录因子(STAT)1和STAT2蛋白。这些转录因子与IRF-9相关联,形成一个异源三聚复合体复合物,即IFN-刺激因子3(ISGF3)。通过在启动子区连接IFN刺激应答元件(ISRE),ISGF3可启动干扰素刺激基因(ISGs)的转录,使病毒处于复制的不同阶段,产生宿主的抗病毒状态。IRF7是合成性ISGs之一,是转录因子IRF家族成员之一。采用IRF7敲除大鼠进行的研究显示,IFN-α和IFN-β转录是依赖于IRF7的,提示IRF7是Ⅰ型IFN的精确调节者。IRF5是IRF家族的另一个成员,可调节Ⅰ型IFN的表达。采用IRF5缺陷大鼠进行的遗传实验显示,对Ⅰ型IFN的诱导不需要IRF5,但TLRs刺激诱导前炎症细胞因子表达时需要IRF5的参与。3.2tlrs型ifn检测TLR是主要的天然免疫细胞表达模式识别受体模式(PRR),能识别病毒衍生出的不同类型核苷,活化信号激酶,诱导Ⅰ型IFN产生。在TLRs中,TLR3、7、8和9与抗病毒天然免疫应答相关联。TLR3识别dsRNA病毒,也参与感知由死亡细胞释放的dsRNA。TLR7和TLR8是G/U丰富的ssRNA受体,带有ssRNA的病毒经内吞进入细胞,病毒核苷酸到达内涵体室,被位于内涵体室膜上的受体识别。TLR3敲除的巨噬细胞对登革病毒具有高度易感性。3.3rnai和工细胞的基因转录和鉴定RIG-Ⅰ存在于胞液中,是感知细胞内病毒dsRNA的受体。在应答细胞内病毒dsRNA时,RIG-Ⅰ通过TLR独立方式诱导IFN产生。敲除RIG-Ⅰ和MDA5的HUH-7细胞亦显示出对登革病毒的高度易感性。3.4RNA干扰(RNAinterference,RNAi)天然免疫防御RNAi通道是无脊椎动物如线虫、锥虫、蛇、蜗虫和昆虫等的天然免疫通道。RNAi主要通过降解特异性mRNAs或抑制其翻译来调节真核生物的基因表达。小干扰RNAs(smallinterferingRNAs,siRNAs)和microRNAs负责执行RNAi功能。siRNAs是非编码RNA分子,由长dsRNA分子衍生而来,microRNAs则由内源性miRNA基因转录而来,它们均以序列特异性方式沉默靶RNAs。RNAi和microRNAs介导的通道在真核细胞基因沉默方面的作用,完全改变了人们以往对基因调节的理解。研究显示,大约30%的人类基因受到miRNAs的调节,编码RNAi蛋白的遗传区域或RNAi成分的突变,将会严重影响细胞的生长与发育,甚至引起致命性缺陷。本课题组曾成功克隆白纹伊蚊RNAi通道的Argonaute和dicer基因片段,这两个片段在白纹伊蚊的各期均有表达,且雌蚊的表达水平高于蚊卵、幼虫、蛹和雄蚊。我们同时发现,白纹伊蚊感染登革病毒前后1~14d内,Argonaute2基因转录水平无明显差异,而感染登革病毒7~14d内dicer基因转录水平明显升高。3结语病毒连接至宿主细胞是感染过程的第一阶段,也是关键性阶段,其过程所涉及的细胞蛋白鉴定与机制大部分仍然未知。从解剖位点来看,DCs构成了天然免疫防御登革病毒入侵的第一道防线。在病毒感染早期,NK细胞分泌的Ⅰ型IFN非常重要。在宿主抗病毒感染天然