血清型登革病毒ns1蛋白型特异性抗原表位基因序列的比较

血清型登革病毒ns1蛋白型特异性抗原表位基因序列的比较

登陆热是由登陆病毒（dad）引起的，主要通过蚊子媒体传播，严重危害人类健康。根据临床表现严重程度的不同,分为登革热(DF)、登革出血热(denguehemorrhagic,DHF)、登革休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS)3种临床类型。据世界卫生组织统计,全球每年有50万人感染登革热,死亡约2.5万人,大约有25~30亿人口处于登革病毒的威胁之下。目前,登革热主要流行于热带、亚热带地区,特别是东南亚、西太平洋以及中南美洲。DV属于黄病毒属,核酸为单股正链RNA,可根据抗原性的不同分为4种血清型(DV1、2、3、4)构成,各型病毒间抗原性有一定交叉。患者感染后对同型病毒有免疫力,但对异型病毒无免疫力,因而可再次感染,目前认为绝大多数的DHF/DSS是病毒二次感染过程中的抗体依赖性增强作用(antibodydependentenhancement,ADE)所致。NS1蛋白是登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白,抗原性极强且不引发ADE,可作为亚单位疫苗候选靶位。本文通过对不同型别的DVNS1基因序列的比较分析,发现其差异,为DV分型及疫苗研究提供新的线索。1材料和方法1.1ns1基因测序从GenBank中选取20株DV基因组全序列,每个血清型各5株,为世界不同地区的流行株,其中新加坡3株、墨西哥2株、泰国2株、尼加拉瓜2株、哥伦比亚2株、委内瑞拉、越南、巴西、柬埔寨、古巴、印度尼西亚、广州、浙江和台湾各1株,重点比对了NS1基因间的差异。1.2dvns1基因缺失、缺失、基因型及氨基酸序列将20株DV基因组全序列输入DNAstar软件包中的Editseq软件中。根据DVNS1基因起始和终止序列(见表1),从全基因组中截取E基因片断,并将其翻译成氨基酸序列。用ClustalX软件对20株DV的NS1基因片段进行多序列比对,分析彼此间的同源性。1.3dv蛋白的碱基位点和氨基酸残基ChenY等发现DVNS1蛋白的型特异性抗原表位在氨基酸残基1~15、71~85和338~352上,对应的碱基位点分别是1~45、211~255和1012~1056。另外,JiangL等也发现了DV的B细胞抗原表位分别在NS1蛋白36~45和187~196位氨基酸残基上,对应的碱基位点是106~135和559~588。用1.2中的方法在DVNS1基因上分别截取上述抗原表位基因片段并进行比对。1.4dv-2型dv-2型根据1.3中的分析结果,又从GenBank中下载了120株DV的基因组序列,其中DV-1型(GenBank号分别为:HM631850.1、HQ166037.1、GU131748.1、HM488256.1、HQ166035.1等)和DV-2型(GenBank号分别为:HQ705625.1、HQ026763.1、HQ705624.1、HQ541792.1、GQ398265.1等)各50株;DV-3型(GenBank号分别为:HQ166034.1、HQ541791.1、HQ166032.1、HQ166031.1、HQ166030.1、HQ705623.1、HQ705610.1、HQ541789.1、HM756281.1、HM631862.1)和DV-4型(GenBank号分别为:EU854301.1、EU854300.1、FJ182017.1、FJ182016.1、EU854299.1、FJ882592.1、FJ882591.1、FJ882590.1、FJ882583.1、FJ882580.1)各10株。2结果2.1dv-ns1基因的形态通过对截取的DVNS1基因进行同源性分析,发现DV4个血清型间核甘酸序列同源性在80%左右,型内病毒间的核苷酸同源性均在90%以上,可见NS1基因相对比较保守。对截取结果进行分析发现,不同血清型DV的NS1基因大小完全相同,为1056bp,编码352个氨基酸,没有明显的缺失或插入突变,但由于不同分离株的长度不同,因此NS1基因在全序列中的位置也有较大差异。使用ClustalX分别建立上述序列的核苷酸同源性系统树(图1)和氨基酸同源性系统树(图2),比较发现核苷酸同源性系统树与氨基酸同源性系统树具有高度一致性,与上述数据描述相吻合。2.2dv血清学分型依据通过对不同的DVNS1蛋白型特异抗原表位区核苷酸和氨基酸序列进行比对,发现NS1蛋白36~45和71~85位氨基酸高度保守,型内完全相同且型间不同(表2)。对应的核甘酸序列106~135和211~255位的碱基并不完全相同,但未引起氨基酸的变异(表3)。基于NS1蛋白型特异性抗原表位36~45和71~85位氨基酸型内的高度保守性,可将其作为DV血清学分型的依据,即NS1蛋白型特异性抗原表位36~45位和71~85位分别是ADSPKRLSAA和ISNELNHILLENDMK的为DV-1型;是PESPSKLASA和ITPELNHILSENEVK的为DV-2型;是ADSPKRLATA和IANELNYILWENNIK的为DV-3型;是PESPARLASA和ITNELNYVLWEGGHD的为DV-4型。另外187~196位氨基酸的保守性也比较高,仅DV-3有一个碱基(I/V)有差异。由于型特异性抗原表位36~45和71~85氨基酸保守性高,变异率低,加上NS1基因具备抗原性强的特点,因而可作为亚单位疫苗研究中合成抗原决定簇的备选基因位点。2.3在20位氨基酸突变型的dv-2和20对120株登革病毒NS1蛋白型特异性抗原表位36~45和71~85位氨基酸进行比对(表4),发现在50株DV-1中,有3株NS1蛋白相应序列的氨基酸位点发生了变异,但这3株病毒来自不同地区,流行年代也不相同,加上在每个位点上发生变异的毒株只有1个,因此该变异出现几率低,推测这3个变异为偶然发生,不影响前述结论。在50株DV-2中,比对区域共有2个氨基酸位点发生了变异。其中1个位点为第73位氨基酸,推测这个变异为偶然发生,不影响前述结论。另1个位于80位氨基酸,该位点分别向两个方向发生突变,其一为发生在泰国2001年的变异,80位氨基酸都由丝氨酸变成丙氨酸,其二为发生在新加坡2007和2008年的变异,80位氨基酸都由丝氨酸变成了苏氨酸。经过进化树分析,发现泰国2001年流行的7个毒株同源性超过了99%,而新加坡毒株的同源性超过了96%。显然,DV-2的71~85位氨基酸出现了型内有规律的变异,不能认为其保守,因此可能其不太合适作为DV血清学分型的依据,但是目前该型没有发现合适的保守位点。10株DV3和10株DV4在这两个抗原表位上没有出现变异位点,不影响前述结论。对120株登革病毒NS1蛋白另外3个抗原表位1~15,187~196和338~352位氨基酸进行比对(表5),发现了一些有规律的变异。这些毒株虽然来自不同的地方和流行年代,但对其序列进行进化树分析,同源性都极高。DV-1的15个毒株NS1基因序列同源性都超过99%,DV-3的3个毒株NS1基因序列同源性超过97%,DV-4的4个毒株NS1基因序列同源性超过98%。由此可见,不同地区和流行年代分离的毒株可能出现相同的变异,因此推测氨基酸位点的变异与流行区域和流行年代并无必然联系,具有一定的随机性。但从进化树分析来看,本研究中重要抗原表位的变异可能与同源性有关,即同源性高的毒株发生相同变异的可能性更高,据此推测发生变异的毒株可能来自同一个传染源。3dv分型小鼠亚单位疫苗的获得和鉴定NS1蛋白是唯一能在细胞表面表达和分泌到细胞外的非结构蛋白,具有登革病毒型和群特异性抗原决定簇,高度保守,可能与病毒毒力有关。另外,NS1存在3种形式,单体NS1呈水溶性,存在于感染细胞内质网腔中,是NS1蛋白成熟过程的中间形式;NS1蛋白的同源二聚体疏水性较单体强,与胞内膜系统结合,可能参与病毒基因组复制,或位于细胞表面,与细胞膜相连,可能涉及信号通路的调控;在哺乳动物细胞中,NS1蛋白还可形成3个二聚体组成的同源六聚体,以可溶性形式分泌于胞外,可诱导产生抗体。基于NS1蛋白在DV感染中的重要作用,本研究对其已确定的型特异性抗原表位对应的核苷酸序列进行比对分析,以明确其变异规律。ChenY和JiangL等都曾利用具有DVNS1型特异性和交叉反应的单抗和各型DV分别免疫小鼠,取血清进行酶联免疫吸附试验(ELISA),分别确定了氨基酸残基1~15、71~85和338~3523个以及36~45和187~196两个型特异性抗原表位,该方法灵敏可靠。本研究所选取毒株来自于不同地域和时期,基本涵盖登革高发区和已知大规模流行事件,因此比对的结果具有代表性。本研究发现通过测定NS1基因特定位点的核苷酸序列及确定对应的氨基酸序列即可推断DV的型别,确定了同型不同株间有差异的片段,36~45位氨基酸可作为DV分型及制备亚单位疫苗的依据。另外,KyungMinChung等人通过竞争性结合实验、酵母表面展示技术及原核表达系统获得了若干西尼罗病毒NS1全蛋白的单克隆抗体,依照各自的结合位点将NS1蛋白分为FR-I、FR-II和FR-III3个亚区。本次研究发现的4个具有一定规律性的变异位点中,第6、9和80位氨基酸分别位于FR-I亚区,而第347位氨基酸位于FR-III亚区。用针对NS1蛋白不同亚区的单抗对免疫缺陷型小鼠进行的免疫保护性实验证明,不同亚区可采取补体依赖或FcRγ依赖的方式诱发机体产生保护性抗体。据此推测这四个位点的变异很可能会影响到NS1蛋白的结构,导致其无法形成二聚体,进而影响其诱发机体产生相应的保护性抗体的功能,使宿主抵抗病毒感染的免疫力下降,进而加速新一轮的暴发流行。经过流行病学调查,发现这些毒株来源的国家和年代大部分(泰国2001年、新加坡1995和2007年、墨西哥2007年、委内瑞拉2004年、哥伦比亚2001和2006年、尼加拉瓜2009年、印度尼西亚2004年)都发生过