香青兰总黄酮的血管舒张作用

香青兰总黄酮的血管舒张作用

0香青兰的药养制剂香兰是嘴唇科的一种一级植物。干燥的部分是一种被称为“多酚国家卫生标准”（1999年版）的医疗产品，其制剂是“益心巴比亚”。“心脑营养、利尿、止哮喘”，“用于治疗精神疲劳、失眠、躁动、哮喘和虚弱”。现代药理学研究表明,香青兰对异丙肾上腺素诱发的小鼠心肌缺血损伤有保护作用,临床研究也表明,香青兰对冠心病、心绞痛有一定治疗作用,且具有降低胆固醇、改善血脂异常的作用。目前,香青兰药理活性的作用机制和物质基础仍不清楚,本研究观察了香青兰总黄酮对大鼠离体胸主动环舒张功能,并探讨了其作用机制,旨在为香青兰的临床应用提供依据。1材料和方法1.1试剂与仪器香青兰购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院,经鉴定为香青兰(DracocephalumMoldavicaL.)地上部分。按文献所述方法制备香青兰总黄酮(DTF),比色法测定其纯度为87.4%。左旋硝基精氨酸甲酯[N(omega)-nitro-L-arginine-methyl-ester,L-NAME]、亚甲蓝(Methyleneblue)、吲哚美辛(Indomethacine)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)均为Sigma公司产品。其余试剂为国产市售分析纯。本研究所用试剂均以MilliporeMilli-Q超纯水配制。K-H液(mmol/L):NaCl118.0,KCl4.7,KH2PO41.2,MgSO41.2,NaHCO325.0,glucose5.5,CaCl22.5。临用前配制,0.22μm除菌滤膜过滤后使用。1.2血管环的张力及张力的测定方法如文献所述。实验用雄性SD大鼠购自新疆医科大学实验动物中心(合格证号:SCKX新2003-009),体重250~300g,10%水合氯醛(350mg/kg,ip)麻醉后,迅速游离胸主动脉,置于通以95%O2+5%CO2混合气体的4℃K-H液中,剔除周围组织,将血管条剪成约3~4mm宽的血管环,避免过度牵拉以损伤内皮。根据实验需要,用棉签磨擦血管环内表面,以去除内皮细胞。将血管环一端固定,一端连接张力换能器,放入含K-H液的浴槽内,持续通以95%O2+5%CO2的混合气体,将静息张力调至2.0g,使用BIOPAC(MP150型,USA)多道生理记录仪记录血管环的张力变化。在37℃下稳定90min,期间每20min换液一次。用KCl(60mmol/L)重复刺激3次,以诱发血管的最大收缩幅度。用ACh检验血管内皮活性,待动脉环稳定后,换液一次,浴槽中加入10μmol/L去甲肾上腺素(NE),收缩达峰值15min后,加入10μmol/LAch检验血管内皮完整程度(预收缩的血管舒张程度大于90%,可认为内皮完整,舒张程度小于10%则认为去除内皮成功)。1.3香青兰总黄酮的作用及对血管的影响血管环基础张力的测定方法如文献所述。香青兰总黄酮对血管环基础张力的影响:当内皮完整或去除内皮的血管环在静息状态下稳定后,采用累积加药方法,每隔10min加入香青兰总黄酮(10mg/mL,预先溶于K-H液),使灌流液中香青兰总黄酮浓度分别达10、20、30、40mg/L,记录血管环张力变化,对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。香青兰总黄酮对KCl、NE预收缩的血管环张力的影响:当内皮完整或去除内皮的血管环达稳定状态,分别用KCl(60mmol/L)或NE(10μmol/L)预收缩血管达稳态后,按上述累积加药方法,观察香青兰总黄酮对KCl或NE预收缩内皮完整或去内皮血管环张力的影响,对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛对香青兰总黄酮作用的影响:内皮完整的血管环分别用0.1mmol/LL-NAME、10μmol/L亚甲蓝预处理15min,10μmol/L吲哚美辛预处理20min,再加入NE(10μmol/L)预收缩血管达稳态后,按上述累积加药方法观察香青兰总黄酮对血管张力的影响,对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。香青兰总黄酮对外Ca2+内流引起血管收缩的影响:按文献方法使去内皮血管环稳定后,换成无钙K-H溶液稳定10min,加入NE(10μmol/L)孵浴20min,加入40mg/L的香青兰总黄酮孵育10min(对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮),然后逐步加入CaCl2至3mmol/L,观察香青兰总黄酮预处理对血管环张力变化的影响。香青兰总黄酮对内Ca2+释放引起血管收缩的影响:按文献方法使去内皮血管环稳定后,用K-H溶液孵浴血管环40min,换无钙K-H液继续孵浴15min,加入NE至终浓度为10μmol/L,使血管收缩,记录最大张力变化幅度值作为相收缩幅度1(Con1)。待收缩稳定后换用含钙K-H液孵浴40min,其间更换K-H液3次,至血管条达基础张力,再换无钙K-H液孵浴5min,更换新的无钙K-H液后加入香青兰总黄酮(至终浓度为40mg/L)孵浴10min(对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮),加入NE(至终浓度为10μmol/L)收缩血管,记录最大张力变化幅度作为相收缩幅度2(Con2)。以香青兰总黄酮处理组与对照组间Con2/Con1×100%的差别,反映香青兰总黄酮对细胞内钙释放引起血管收缩的影响。1.4血管张力的测定上述实验均重复8次,实验结果均以NE(10μmol/L)或KCl(60mmol/L)诱发的最大收缩幅度为100%,药物处理后的血管张力幅度变化以其百分率表示。所有数据均以mean±SD表示,采用SPSS10.0统计分析软件,以ANOVA中t检验(Newman-Keuls法)进行显著性检验,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1血管黄酮对香青兰血管本身基础张力的影响与空白对照组比较,香青兰总黄酮浓度累加至40mg/L,对内皮完整和去内皮血管环张力未见明显影响(P>0.05,图1),表明香青兰总黄酮不影响血管本身基础张力。2.2香青兰总黄酮对kcl预收缩内皮完整和去内皮血管环张力的影响与空白对照组比较,香青兰总黄酮浓度累加至40mg/L,对KCl(60mmol/L)预收缩内皮完整和去内皮血管环张力未见明显影响(P>0.05,图2),表明香青兰总黄酮对电压依赖性钙通道开放所致细胞内钙释放引起的血管收缩没有影响。2.3香青兰总黄酮的浓度对构NE(10μmol/L)可使内皮完整和去内皮血管环收缩,香青兰总黄酮可浓度依赖性地使NE预收缩的内皮完整主动脉血管环显著舒张,香青兰总黄酮也可浓度依赖性地使NE预收缩的去内皮血管舒张,但作用强度不及内皮完整的血管环(图3)。表明香青兰总黄酮诱导的血管舒张更大程度上依赖于血管内皮的完整性。2.4内皮内叶吸附nd-pgi2基因后抑制香青兰总黄酮的no和pgi2基因表达采用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME(0.1mmol/L)、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(10μmol/L)和环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μmol/L)预处理内皮完整血管环,均可一定程度上抑制香青兰总黄酮所致的NE预收缩血管舒张,但均未能完全抑制香青兰总黄酮所致血管舒张(图4),表明香青兰总黄酮可通过活化内皮依赖性的NO和PGI2通路舒张2.5外钙内流对血管收缩的影响采用去内皮血管环观察了香青兰总黄酮(40mg/L)预处理对细胞外钙所致血管收缩的影响,结果表明香青兰总黄酮可明显抑制细胞外钙所致的血管收缩作用(图5),说明香青兰总黄酮可通过抑制外钙内流,从而抑制血管平滑肌细胞收缩。通过观察香青兰总黄酮处理前后细胞内钙释放所致去内皮血管收缩幅度表明,香青兰总黄酮处理对细胞内钙释放所致的收缩与空白对照组没有明显差异(71.3±2.60vs72.34±2.85,P>0.05),表明香青兰总黄酮对内钙释放所致血管收缩没有影响。3香青兰总黄酮预处理对血管内皮外流和血管收缩的作用血管张力的大小直接影响外周血液循环的阻力,从而影响血压和心脏负荷水平,血管扩张剂可以改善冠心病或心力衰竭时的心脏供血,减少心脏做功,成为临床重要的治疗手段之一。本实验采用大鼠离体胸主动脉灌流技术,观察香青兰总黄酮对血管张力的影响,发现香青兰总黄酮对去甲肾上腺素预收缩的内皮完整和去内皮血管均有舒张作用,而对内皮完整血管的舒张作用更强,表明香青兰总黄酮舒张血管作用更大程度上依赖于血管内皮。去甲肾上腺素(NE)主要作用于血管平滑肌细胞α1肾上腺素受体,激活磷脂酶C信号通路,一方面活化细胞膜上受体依赖性钙通道(ROC)和电压依赖性钙通道(VOC)的开放,增加细胞外钙的摄取;另一方面刺激细胞内钙释放,从而导致血管收缩。血管内皮作为调节血管张力最主要的组织结构之一,可通过合成并分泌内皮依赖性舒张因子———一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2),作用于血管平滑肌细胞,前者通过活化血管平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶,活化cGMP依赖信号通路而舒张血管平滑肌,后者激活平滑肌细胞内cAMP依赖的信号通路导致血管舒张。在NE预收缩的内皮完整血管环上,NO合酶抑制剂L-NAME和环氧合酶抑制剂吲哚美辛均可一定程度地抑制香青兰总黄酮的血管舒张作用,但并未完全抑制香青兰总黄酮的作用,表明NO和PGI2信号通路均参与了香青兰总黄酮对内皮完整血管的舒张作用,但香青兰总黄酮的舒张血管作用尚有其他途径参与。在去内皮血管环中,NE诱导的血管收缩主要与血管平滑肌细胞外钙内流和内钙释放有关。本实验采用无内皮血管环研究发现,香青兰总黄酮预处理可抑制外钙内流引起的血管收缩。细胞外高钾可造成血管平滑肌细胞膜电位去极化激活VOC,导致细胞外钙内流而引起血管收缩,本实验中香青兰总黄酮对高钾所致动脉环收缩没有明显影响,表明香青兰总黄酮的血管舒张作用与VOC活化无关,进一步研究发现,去内皮血管中香青兰总黄酮预处理对内钙释放所致血管收缩也没有明显影响。上述结果表明,香青兰总黄酮主要通过抑制ROC,抑制了平滑肌细胞的外钙内流所致的血管收缩。香青兰作