无标记检测技术在现代检验医学中的应用

无标记检测技术

在现代检验医学中的应用世界现代化与第六次科技革命在过去500年里，世界上先后大约发生了五次科技革命，包括两次科学革命和三次技术革命中国与前四次科技革命无缘；失去四次科技革命的机会，中国的国际地位一路下滑以社会生产力（按购买力平价计算的人均国内生产总值）为例，1700年中国社会生产力水平排名世界第18位，1820年排第48位，1900年排第71位，1950年排第99位。目前，世界正处于第六次科技革命的前夜，第六次科技革命将是中国复兴的一次历史性机遇，值得科技界和全社会重视和思考2科技革命大致时间主要内容第一次16~17世纪近代科学的诞生第二次18世纪中后期蒸汽机和机械革命第三次19世纪中后期电力和运输革命第四次相对论和量子论等第五次20世纪中期电子技术和自动化20世纪中后期信息技术和网络化第六次21世纪中期新生物学革命，新生命生物与技术融合第六次科技革命的方向和挑战从人类文明和世界现代化的角度看，第六次科技革命将以生命科学为基础，融合信息科技和纳米科技，提供解决和满足人类精神生活需要的最新科技从科学革命角度看，第六次科技革命有可能是新生物学革命检验医学的发展与技术革命息息相关3第六次技术革命

给检验医学带来的机遇与挑战无标记检测技术高通量测序技术与个体化治疗3D打印技术单细胞检测组学纳米医学精准医学互联网加大数据分析可穿戴式检验设备45有标记检测检测灵敏度高、特异性好，但是，任何标记均对生物分子和细胞存在一定的损害性(如细胞毒性)，不能还原分子和细胞的真实信息无标记检测能达到甚至超过有标记检测的灵敏度和特异性，是一种无损检测，能够实时动态地还原分子和细胞结构和功能变化等真实信息无标记检测技术无标记检测是检验医学追求的终极目标之一太赫兹波谱检测技术6细菌快速侦检是临床微生物检验亟待解决的实际需求细菌快速侦检是临床及时、准确判断是否感染及合理使用抗生素的重要依据巴斯德和科赫在19世纪建立的细菌培养方法仍然是临床微生物检验的主流技术与检验医学其它技术的飞速发展相比较，临床微生物检验的发展相对滞后7路易斯·巴斯德法国微生物学家罗伯特·科赫德国微生物学家结核分枝杆菌流感嗜血杆菌血平板细菌培养琼脂糖平板培养AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27现有技术尚不能有效解决8不能绕过细菌培养AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27PCR基因芯片第二代测序蛋白组质谱细菌培养这一制约细菌快速侦检的关键问题蛋白组质谱：基因诊断技术：第二代测序：不同种属的细菌需要特定引物或探针，无法替代传统的细菌培养种属鉴定发展前景良好，但因技术和成本原因，临床应用尚需时日

摒除细菌培养环节，直接定性和定量检测是细菌快速侦检期待解决的关键科学问题有必要寻求能够有效解决上述问题的跨学科检测理论与技术9Nature.2002May9;417(6885):132-3AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27近年来出现的太赫兹(terahertz,THz)技术为细菌的快速侦检提供了一个良好契机THz波是指频率在0.1~10THz范围内的电磁波生物大分子的弱相互作用、骨架振动和偶极子旋转等正好处于THz频谱范围由于缺乏有效的THz波产生与检测方法，曾一度被称为“THz间隙”10THz波是最后一个尚未充分开发利用的电磁波段2005年以来，

“THz间隙”逐渐得到填补，为THz波生物医学应用研究提供了技术支撑和发展契机改变未来世界的十大技术之一；国防重点学科设置了系列国际合作项目(如：THz-BRIDGE、THz-BEAM)国家科技发展规划明确指出THz波技术在生物医学应用研究领域的重大战略地位THz波生物医学应用研究是当今学科交叉前沿2005年第270次：太赫兹科学技术的新发展2014年第488次：THz波生物医学应用中的科学问题与前沿技术(本项目团队作为核心成员发起并承办)两次香山科学会议美国：欧洲：中国：THz波快速侦检细菌的理论基础12AdvBiosciBiotech.2013Mar;4:493-503AmJBiomedEng.2012;2(4):143-15412每种生物大分子均有特定THz波谱指纹THz波可穿透整个细菌，以纯物理过程获取细菌的生物大分子信息通过解析THz波谱，可区别不同细菌的分子结构、组成和丰度差异，实现细菌的无标记直接检测13AdvBiosciBiotech.2013Mar;4:493-503AmJBiomedEng.2012;2(4):143-15413种属特异性差异分子鉴别细菌种属：区分死菌与活菌：检测细菌耐药性：G+菌的胞壁磷壁酸G-菌的胞壁质脂蛋白G-菌的脂多糖链球菌的M蛋白金葡菌的A蛋白大肠杆菌的硫氧化还原蛋白脂质、蛋白质和线粒体等的构象与组成耐药质粒、药物代谢酶大肠杆菌的硫氧化还原蛋白大肠杆菌与枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌死菌与活菌我们的前期研究构建了基于THz时域光谱的生物传感器平台建立了THz波谱解析方法，并成功应用于多种生物大分子的解析dsDNA和ssDNA 血红蛋白链球菌的M蛋白

金葡菌的A蛋白初步证实了THz波检测细菌的可行性金黄色葡萄球菌和大杨杆菌存在显著的THz波谱特征差异透射式THz时域光谱系统球菌和杆菌的亚THz振动光谱差异dsDNA的THz波谱差异JBiomedOptics,2014(Accepted)AnalBioanalChem.2012;402(4):1625-1634JInfraredMilliTerahzWaves.2014;35:318-324THz波在细菌快速侦检测领域具有巨大的应用前景证实：THz波检侦细菌具有其它技术无法比拟的优势THz波飞行质谱分子诊断传统方法检测原理分子和菌体的THz波谱指纹菌体蛋白质组特征峰引物扩增、探针检测细菌生长与生化鉴定细菌培养不需要需要不需要需要完成时间<10min>24小时培养+检测1~2小时>48小时培养鉴定操作过程简便简便相对复杂相对复杂配套试剂无无需要需要活菌/死菌鉴别能否否否成像能力图谱合一否否能在体检测能否否否15无需标记、无需试剂、实时检测、简便快速我们的研究结果提示：THz波技术

用于细菌快速侦检尚需要解决两个关键问题16特异性：不同分子和细菌的THz波谱存在相互干扰灵敏度：达不到细菌快速侦检的预期检测需求水敏感性：THz波的水吸收干扰使其难以适用于临床生物样本检测需要引入新的技术手段获得有效的THz波谱检测信号1、THz波谱信号的放大与保真：获取细菌的THz波谱信号17本项目拟研发的亚THz纳米生物传感器及其波谱解析技术可有效解决上述问题2、THz波谱解析：物理信息与医学信息的相互转化国内外尚无细菌的THz波谱数据库现有解析方法不适用于临床样本的液相检测条件缺乏有效的识别算法与相关软件研究内容与实施方案在已有的工作基础上，研究能够使THz具备细菌快速侦检能力的三大关键技术181.亚THz纳米生物传感器关键技术的研究微流体技术狭槽纳米天线技术亚THz传感技术拟解决的关键技术一：特异性所处复杂检测环境存在分子和细菌的THz波谱相互干扰，达不到识别单细胞的信噪比需求例如：不同种属细菌、不同种类分子的THz波振动波谱相互干扰19已有的研究均主要集中于单一分子或细胞检测解决途径：微流体技术20微流体的微腔道可实现单细菌的分离与制备NatProtoc.2014Mar;9(3):694-710具备识别单细胞的信噪比，为无需细菌培养、单细菌水平直接检测提供技术途径20构建微流体样本池：微细加工技术分析样本池基质特性：聚四氟乙烯、聚苯乙烯、picarin等基质的THz波参数研究微腔道工艺参数：单元壁厚度、直径、表面修饰方式21技术目标：单个细菌依次通过THz光源探测处集成了狭槽纳米天线的微流体样本池结构示意图拟解决的关键技术二：灵敏度THz波检测灵敏度与检验医学临床需求失配，仍然无法摒除细菌培养而实现细菌的直接检测22NanoLett.2013Apr10;13(4):1782-6AmJBiomedEng.2012;2(4):143-154THz波现有技术预期的检测需求质量灵敏度分子mg级pg~μg级细菌102~103个1个尺度灵敏度分子30μm~3mmnm细菌30μm~3mm<15μm解决途径：纳米光学天线的信号极端放大23狭槽纳米天线：非对称电磁场环境能够极大地增强纳米狭槽的局域表面等离子体共振，使检测灵敏度提高103~1012倍；同时，可突破THz波物理衍射极限，匹配分子和细菌的检测尺度纳米光学天线：自由传播光场与局域能量间相互转换的一种装置一般是金属(金、银等)纳米颗粒(球形、三角形、棒状等形状)及其相同结构的不同组合NanoLett.2013Apr10;13(4):1782-6构建狭槽纳米天线检测单元：自组装技术分析检测单元金属粒子特性：粒子种类和大小、金属膜厚度等物理特性研究狭槽纳米天线参数：直径、宽度、长度、三维比值等24技术目标：THz波探测灵敏度达到单细胞水平集成了狭槽纳米天线的微流体样本池结构示意图拟解决的关键技术三：水敏感性细菌检测特点：液相条件人体来源样本的共性——体液(液态水)检测环境水干扰——大气中的水蒸汽25THz对水非常敏感，会导致严重的水吸收干扰，已有的研究均主要集中于固相条件及干燥环境克服水吸收对靶标检测的干扰AmJBiomedEng.2012;2(4):143-154解决途径：THz频段优化亚太赫兹(sub-THz)：<1.0THz的频谱范围26亚THz频段的水敏感性远低于现有常用THz频段(>1.0THz)>1.0THz波段水蒸气吸收峰较密，吸收系数较高，导致信噪比低<1.0THz的波段，吸收峰较少，峰值较低大气水蒸汽THz吸收谱液态水THz吸收谱IEEESensJ.2013Jan;13(1):72-29亚THz波特别适合于液相检测2.亚THz纳米生物传感器快速侦检细菌的新技术与新方法27通过数据库波谱解析，获得细菌的特征波谱，实现单细胞水平的细菌定性检测逐一记录流经检测单元的不同性状细菌的数量，实现细菌的定量检测(1)整合亚THz、微流体、狭槽纳米天线等三大关键技术器件，构建亚THz纳米生物传感器(2)不同细菌的THz波谱特征解析及数据库的建立生物信息学手段获得不同细菌的差异分子细菌差异分子波谱参数的分子动力学模拟与实验确认设计波谱指纹自动识别软件构建包含20~30种细菌的初级亚THz表征波谱指纹数据库283.亚THz纳米生物传感器的临床应用研究以结核杆菌为模式生物，采用亚THz纳米生物传感器检测50~100例临床样本以现有方法为对照，评价亚THz纳米生物传感器的方法学参数，使亚THz波谱成为细菌快速侦检的新指标29特色与创新亚THz纳米生物传感器具备三大技术突破与创新亚THz传感技术降低了水敏感性的干扰，实现液相样本的检测微流体技术可制备与分离单细胞，提高检测的特异性狭槽纳米天线是信号极端放大系统，达到检测单细胞的灵敏度亚THz纳米生物传感器是“以分钟计的革命性微生物检测新技术和新方法”无需细菌培养、无需标记、无需试剂、实时检测、简便快速(2~3分钟)、直接定性和定量检测亚THz波谱是细菌检测的新指标，可广泛应用于感染性疾病的诊治与预防30乳腺癌在全世界范围内，乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤，约占罹患恶性肿瘤女性总数的23%；死亡率逐年上升。乳腺癌的早期准确诊断和病理分型对于患者个体化精准治疗有极为重要的意义。不同分子分型的乳腺癌的流行病学危险因素、疾病自然进程及全身或局部治疗反应不尽相同。2011年国际乳腺癌大会上形成专家共识，可根据免疫组织化学检测的ER、PR、HER-2及Ki-67结果确定乳腺癌的分子分型。分子亚型免疫组化表型临床治疗及预后luminalAER（＋）

和（或）PR（＋），HER-2（－），Ki-67阳性细胞数＜14%最常见的类型，预后最好，内分泌治疗luminalB①ER（＋）和（或）PR（＋），HER-2（－），Ki-67阳性细胞数≥14%细胞增殖速度快，内分泌治疗加化疗②ER（＋）

和（或）PR（＋），HER-2（＋），Ki-67阳性细胞数不限内分泌治疗联合抗HER一2靶向治疗HER-2过表达ER（－）和PR（－），HER-2（＋）恶性度高，预后较差，有转移倾向，行化疗及抗HER-2治疗基底样型ER（－），PR（－）和HER-2（-），表达基底细胞角蛋白和肌上皮标记物预后最差，外科手术加化疗正常乳腺样ER（－），PR（－）和HER-2（-），表达正常脂肪组织基因恶性度低，预后较好，对化疗不敏感基于太赫兹时域光谱技术检测乳腺癌组织和正常乳腺组织标本的结果显示THz波技术在组织层面具有良好的区分度。但仍需从细胞层面揭示差异的根本来源，从而为早期诊断、分子分型及组织成像等精准医疗中应用奠定基础。Fig.Theterahertzspectroscopicpropertiesforwaterandbreasttissues.PLoSONE(2014)9:1–9乳腺癌基于太赫兹时域光谱技术对Hela细胞的单细胞层研究表明，复介电常数虚部与胞内生物大分子及水动力学相关的慢弛豫过程参数具有显著差异性；揭示太赫兹时域光谱技术能够在皮秒及亚皮秒时间尺度探测胞内生物大分子水合动力学等关键信息；可实现活细胞无标记整体检测。JInfraredMilliTerahzWaves(2014)35:493–502乳腺癌乳腺癌本973课题组前期利用太赫兹时域光谱技术对乳腺癌MCF-7（LuminalA型）与MDA-MB-231（Basal型）细胞系细胞悬液进行初步研究；显示两种悬液的吸收系数存在显著差异。拉曼光谱检测技术35拉曼光谱(Ramanspectra)拉曼光谱是生物大分子对光子的一种非弹性散射指纹光谱，能够精确反应人体细胞中生物大分子组分的变化信息，并且，是一种具有极强特异性的无标记检测技术36拉曼光谱无标记检测的基本原理在于，待检测靶标(细胞及分子)与正常细胞或分子相比较，存在质与量的显著差异，通常具有特征性的拉曼光谱指纹图谱，因此，可通过细胞或分子的特征性拉曼图谱实现已知和未知靶标的检测37正常肺细胞SAEC、肺癌细胞A549及分别经过阿霉素DOX处理后细胞的平均拉曼光谱图(A)和拉曼光谱经过主成分分析的二维视图(B)肺癌和乳腺癌细胞的拉曼光谱鉴定.A:肺癌细胞A549、乳腺癌细胞435、和具有转移抑制基因的乳腺癌细胞435/BRMS1的平均拉曼光谱图；B-C:肺癌细胞A549、乳腺癌细胞435和具有转移抑制基因的乳腺癌细胞435/BRMS1的拉曼光谱主成分分析三维视图(B)和聚类图(C)38拉曼光谱用于生物样本检测分析具有显著优势：39样品无需接触样品无需制备快速分析检测适合含水样品成像快速简便适合差异分析

…………有助于提升我国拉曼光谱研究与应用的国际影响力有助于占领人与动物血液样本直接无损检测制高点有助于打赢西方对我国基因资源掠夺的基因保卫战以人与动物血液快速非接触甄别的特殊需求为导向，基于RAMAN光谱技术，优化适合于人和动物血液样本拉曼光谱检测分析参数，阐明人与动物血液成分的光谱特征，构建人与动物血液拉曼光谱数据库，最终建立人和常见动物血液快速甄别数学模型，为“人与常见动物细胞非接触式识别装置研发”提供RAMAN光谱分析方法及数据库支持。 41通过对血液样本拉曼特征光谱的实验研究和规律探索，初步获取不同种属及不同状态血液样品的拉曼光谱基本特征参数人、犬、兔血液拉曼光谱差异性人和狗，兔子血液拉曼特征峰差异性（1157cm-1）：全血（A）和干的血液（B）BA

人兔子狗全血0.480.200.15干的血液0.830.230.09人和动物特征峰峰面积比值（1157/1003cm-1

）人和动物1157cm-1特征峰强度存在一定的差异性人和猴子血液拉曼光谱差异HumanMonkey峰位置75510031223137613971549156415821603161916351653人全血0.921.000.900.240.392.611.852.370.992.511.046.05猴全血1.261.000.271.127.042.982.202.280.962.552.760.33人和猴子血液（全血）拉曼特征峰面积的比值（以1003cm-1为参考）人和猴子血液拉曼光谱差异HumanMonkey峰位置75510031223137613971549156415821603161916351653人全血0.921.000.900.240.392.611.852.370.992.511.046.05猴全血1.261.000.271.127.042.982.202.280.962.552.760.33人和猴子血液（全血）拉曼特征峰面积的比值（以1003cm-1为参考）SPR生物传感器检测技术4546表面等离子体共振（SPR）是一种物理光学现象，利用金属膜和液面界面，光的全反射引起的物理光学现象,可灵敏分析分子间的相互作用47纳米金信号放大系统应用特异性识别分子与生物素修饰靶标复合体捕获链霉亲和素修饰的纳米金磁微粒，增加传感器表面附着量，成功建立了纳米金信号放大系统选用了生物素-亲和素这一具有高亲和力的配对分子作为信号放大的连接元件，不仅具有较高的信号放大效率和特异性，而且具有高通用性

传感器芯片生物素化靶标纳米金磁颗粒特异性识别分子48抗原-抗体相互作用动态监测研究：在SPR免疫传感器芯片上固定特异性抗体，用以监测其与4种尿液中的微量蛋白的相互作用，抗原抗体反应变化趋势明显、直观，便于分析SPR传感器自动分析系统应用研究

免疫传感器芯片检测尿液中微量蛋白的实时动态分析49定量分析研究：微量蛋白浓度与SPR角呈线性关系，线性拟合后R2

均高于0.98灵敏度研究：4种尿微量蛋白的检测灵敏度与放射免疫分析法相当，优于ELISA法、火箭免疫电泳自显影法

A1M5pg/mlB2