我国登革病毒诊断方法的研究进展

我国登革病毒诊断方法的研究进展

登吉热是由埃及蚊子和白纹蚊引起的急性病毒传播的疾病。现在，它是世界上严重的公共卫生问题。目前登革病毒诊断方法主要包括病毒分离、分子生物学检测和血清学方法。其中,前者作为登革病毒诊断的金标准,不但可以检出病毒的存在,还能对病毒的型别进行鉴定,但该方法比较耗时,而且需要一定的仪器设备和专业技术人员;从Banditti早期报道的巢式RT-PCT检测到现在实时荧光PCR检测的应用以及核酸序列扩增技术,分子生物学检测技术在这近十几年来有了较大的发展,其敏感性、特异性和重复性都有了很大的提高,但该方法也存在较高的实验室设备和专业技术人员要求;而利用抗原或抗体检测原理的血清学实验方法,具有操作方便、试剂廉价、诊断快速等特点,较适用于现场诊断,并得到了广泛的应用。登革病毒的血清学诊断方法主要包括血凝抑制(Hemagglutinationinhibition,HI)试验,中和试验(NeutralizationTest,NT)、间接免疫荧光抗体试验(IndirectImmunofluorescentAssay,IIF)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、补体固定试验(Complementfixation,CF)、斑点印迹、免疫层析法(ImmunochromatographicTest,ICT)等。这些方法主要就是对抗原(ELISA、斑点印迹、ICT)或者抗体(HI、NT、IIF、CF、ELISA、ICT、斑点印迹)进行检测。大量的应用实践发现,目前最常用的方法主要为ELISA、ICT和比较传统的HI试验及NT试验。1登革病毒中ns1基因的检测在初次和二次感染的患者急性期血清中都可以通过酶联反应和斑点试验检测到高浓度、以免疫复合物形式存在的包膜蛋白(envelope,E)/膜蛋白(membrane,M)抗原和非结构蛋白1(nonstructuralprotein1,NS1)抗原,甚至在患者发病后9d仍能检测到这些抗原。前者(envelope,E)是登革病毒的主要包膜蛋白,全长494个氨基酸,相对的分子量近60000;不但含有中和抗原表位、型特异表位,还有登革病毒种及黄病毒属特异性表位。E蛋白的A、B两区存在与中和抗体和血凝作用有关的抗体表位,可以诱导宿主产生保护性的中和抗体以及血凝抑制抗体。此外,该蛋白还可能会引起抗体依赖的增强感染作用(ADE),而ADE可导致DHF和DSS的产生。M蛋白(membrane,M)形成病毒毒粒的表面结构,分子量约为8000,由其前体PrM糖蛋白经过特异性酶切后形成;研究发现,M蛋白具有促进病毒感染增强的作用。NS1蛋白属于登革病毒中一种高度保守的非结构性糖蛋白,具有较高的同源性,分为包内型、膜型和分泌型。研究发现其抗原性很强,含有多个T、B细胞表位,能够诱发细胞和体液免疫应答,此外,在登革热病人的血清中还存在较高水平的循环NS1抗原和NS1特异性抗体,且出现时间也早于IgM抗体。SophieAlco等人通过研究发现,甚至在检测不到登革病毒RNA或已有登革病毒IgM抗体存在的情况下,也可能有效检测出NS1蛋白;他们对登革病毒感染者一出现发热到临床期结束的整个过程进行观察发现,登革病毒NS1蛋白均能在各个时间段内的病人血清中检测到,只不过各个时间段NS1蛋白滴度含量有所不同。目前针对E/M蛋白和NS1蛋白检测的方法主要有ELISA和斑点免疫测定,其中ELISA法较为常用。2006年徐华等人采用DEN-1NS1抗原捕获ELISA的方法,对16例临床诊断为DEN1感染患者急性期的血清样品进行检测;并把DEN-1NS1抗原检测阳性样本品15份与试剂盒IgM抗体(澳大利亚PanBio)检测结果进行对比发现,两种方法检测结果中有13例吻合(即IgM抗体和DEN1-NS1抗原检测同时阳性);其余2例IgM抗体阴性,而DEN1-NS1抗原检测呈阳性,结果提示该方法在登革热的发病早期检出效果可能要优于IgM抗体的检测。陈万山等人分别采用传统的病毒分离鉴定法、RT-PCR法以及IgM抗体检测法与ELISA捕获NS1抗原检测法进行对比发现,在登革病毒感染患者发病1～2d、3～5d以及6～10d的血清中,NS1抗原的检出率分别是92.7%(38/41)、83.3%(70/84)、10.9%(5/46),特异性为100%;而IgM抗体检测方法分别为2.4%(1/41)、51.2%(43/84)、97.8%(45/46),特异性为95.2%;RT-PCR法在发病的1～2d,与ELISA检测NS1法结果的差异性不大(P>0.05);但病毒分离方法比NS1抗原方法的检出率要低(P<0.05)。此外,PhilippeDussart采用ICT检测NS1法(DengueNS1AgSTRIP)和两步夹心格式微孔板ELISA检测NS1法(pan-EDengueEarlyELISA)与一步夹心格式微孔板ELISA检测NS1法(thePlateliaDengueNS1AgTest)进行检测比较发现,DengueNS1AgSTRIP检测法的敏感性和特异性分别为76.1%(207/272)和100%(48/48);而pan-EDengueEarlyELISA检测法的敏感性和特异性分别为55.1%(150/272)和97.9%(47/48);thePlateliaDengueNS1Agtest的敏感性和特异性分别为82.4%(224/272)和100%(48/48)。该比较结果说明thePlateliaDengueNS1Agtest是三者中检测效果最好的,可作为早期诊断DEN感染的方法。2关于局部感染的检测登革感染者血清中的抗体检测常见的有血凝抑制(Hemagglutination-inhibition)抗体、中和(Neutralization)抗体、IgM和IgG。其中,血凝抑制抗体是一种能够抑制登革病毒促使红细胞发生凝集现象的特异性抗体,长期以来测定血凝抑制抗体的血凝抑制试验(HI)被广泛应用于登革病毒感染的检测。一般初次感染者急性阶段的抗体多在发病后第5～6d才可检测到(抗体滴度通常大于1∶10);而对于二或三次感染时,抗体滴度通常在发病后第1d就会迅速上升(一般大于1∶24),因此,急性期血清标本抗体滴度在1∶1280以上时,提示近期有登革病毒感染。但最近有学者研究发现,针对登革病毒的初次和二次感染者,HI试验和EILSA试验的检测结果吻合率仅有88%,其原因还有待进一步的研究证实。中和抗体是当人体感染登革病毒后所产生的一种保护性抗体,可以抑制登革病毒的吸附、穿入、从而使其失去感染能力。传统检测中和抗体的实验方法多为空斑减少中和试验,该实验具有较高的敏感性和特异性,特别是针对于初次感染的血清型鉴定。但对于二或三次感染者,由于原始抗原痕迹(originalantigenicsin,OAS)作用的存在,使中和抗体试验的可靠性明显降低。因此,该实验只适用于初次感染的登革热诊断。一般来说,初次感染登革病毒,IgM通常在发病后的5d出现,1～3周内达到高水平,并可维持2个月,有的甚至在6个月时还能检测到;而IgG抗体的出现时间要比IgM晚,多在感染后的2周出现,并可维持终生。在二次感染时,IgM则出现的比较晚,且所产生的水平也较低,维持的时间也不长,常使得一些患者较难检测到IgM;而IgG的产生时间就很快,一般是在出现症状后的1～2d出现,且抗体水平也比既往的要高。为此,在实际应用中,对于初次登革病毒的检测,IgM一般用于检测发病后1周所采集的血液,发病2周后采集的血液就可以采取IgG抗体检测;对于二次感染,在检测可疑病人的血清时,建议同时检测IgM和IgG两种抗体。目前对两种IgM和IgG抗体检测的主要方法有ELISA法、ICT以及IIF(主要检测IgG)。其中,以胶体金快速免疫层析法为代表的ICT检测法是目前较常用的现场快速诊断方法。一方面它对登革热的诊断速度快,仅需5～10min而且不需要特定的实验室设备和专业的技术人员,在现场就可以完成检测;另一方面采用该方法既可检测IgM,又可检测IgG,而且对是否初次或二次感染都可做出初步判断。Lam和Devine早在1998年就提出快速免疫层析法对早期快速诊断登革热感染是非常有价值的。他们用快速免疫层析试验和ELISA捕获法在登革感染期间,对IgM和IgG抗体进行检测,结果发现,两种方法的敏感性和特异性都较高,分别为100%和89%。DavidW.Vaughn和AnandaNisalak等人用ICT对登革病毒感染患者的血清检测IgM和IgG抗体时发现,其敏感性和特异性也分别高达100%和88%。何似、陈润等人采用ICT和IIF对56份疑似登革热病人的血清和68份无症状人群的血清分别进行了IgG的检测,在前者血清的两种检测方法比较中发现,IIF法检测的阳性率为53.6%(30/56),ICT检测的阳性率为46.4%(26/56),两法符合率91.07%,无显著差异(P>0.05);但在后者血清的检测中,IIF法检查的阳性率为54.4%(37/68),而ICT检测得阳性率为33.8%(23/68);两法符合率73.53%,存在显著差异(P<0.01)。此外,徐建民采用抗体捕获ELISA法和快速免疫层析法分别对2000年的322份标本(其中4份确诊为登革热病人)和1999年的311份标本(其中2份确诊为登革热病人)进行了检测,通过对结果数据的比较揭示,快速免疫层析法特别适于在登革热暴发流行期间作初筛试验。3elisa在pcr检测中的灵敏度和敏感性近十几年来,血清学试验技术有了迅速的发展,之间不断有新的检测技术出现。如捕获NS1抗原的ELISA法,其灵敏值可达到10ng/ml。SophieAlcon等建立了类似检测NS1蛋白的方法,参比蛋白采用1型登革病毒NS1蛋白,包被抗体和酶标抗体分别为抗登革病毒1型鼠多克隆抗血清和兔多克隆抗血清,该方法甚至可以检测到含量低于1ng/mL的DEN-1NS1蛋白,但同样的检测水平对于其它型的NS1蛋白不成立,其敏感性可低至10倍。这种差异可能是所用的多抗血清只针对DEN-1NS1蛋白,由于登革病毒NS1蛋白的氨基酸序列同源性并不是很高(一般不超过80%),使得该多抗血清与其它型的登革病毒NS1蛋白的反应效率降低。因此,使用针对某一种型别的NS1抗原不但可以提高该型登革病毒检测方法的灵敏性,还有可能对病毒的型别进行鉴定。最近研究报道,针对于I型和III型登革病毒的NS1特异性单抗已经成功制备;这些都预示着ELISA捕获NS1抗原检测法在未来可以作