近红外光谱技术预测真可消化氨基酸含量的研究

近红外光谱技术预测真可消化氨基酸含量的研究

猪和鸡的理想蛋白模式的研究是目前动物营养研究的热点。未来，猪和鸡的日常饲料将以可消化氨基酸为指标进行混合。但用体内法测定氨基酸消化率费时、昂贵,在实际配方时,各种原料的氨基酸消化率常常通过查表或用体外法来预测。所以近年来营养学家在体外预测氨基酸消化率方面做了大量的研究。体外酶法是估测可利用氨基酸的一个常用的方法但它和其他一些方法都存在测定时间长或者测定费用高这样的缺点。相反,近红外光谱技术(NIRS)却能适应快速分析的需求,它的精度虽低于实测值,但与查饲料成分表和某些体外预测方法相比是可行的,也只有通过NIRS技术才能在配方前测出饲料原料中的可消化氨基酸。NIRS用于预测饲料中真可利用氨基酸的研究还处于探索阶段,国内外进行此项研究的学者不多。魏瑞兰等(1987)用NIRS进行了花生饼的表观可利用氨基酸的定标与测定,结果指出体内法测值与NIRS法之间呈强的正相关(0.85~0.98)。Jackson(1996)用NIRS进行了饲料样品真可消化氨基酸的定标,除胱氨酸外,体内法测值与NIRS法测值之间的相关系数在0.90以上,他认为NIRS法能够获得与体内法相近的数据。由于国内饲料在品种、产地、气侯和加工等方面与国外品种存在差异,所以用国外研究的预测方程预测国内的饲料精度往往差,因此本试验进行了近红外预测棉籽粕、菜籽粕中真可利用氨基酸的定标研究。1材料和方法1.1定标、样品与粉碎方法按照标样筛选原则(产地、样本营养素含量)采集有代表性的棉籽粕、菜籽粕样品,用60(55~75)个左右作定标样品,其它作检验样品。定标用的棉籽粕、菜籽粕样品主要来自河北、河南、江西、山东、新疆、江苏、四川等地各90个样品,其中用浸出法取油后的样品88个;用机榨法的样品2个,所有样品均用Tector1093型密封旋风磨粉碎,样品过1mm孔径的筛,粒度达80~100目。于-4℃冰箱中保存。1.2氨基酸消化率的测定按Sibbald(1979)方法测定,同时用无氮日粮作内源校正,测定定标样品和检验样品的氨基酸真消化率。1.2.3饲料和监狱饲料中氨基酸aa含量测定每个饲料用24只鸡作消化率的测定,分成4个重复,每个重复6只鸡。试验鸡单笼饲养以收集总排泄物。在非试验期,试验鸡自由采食生长期鸡饲料,供水充足,室温控制在20~22℃。试验鸡在饲喂试验料前饥饿48h,使消化道内容物排空,期间每只鸡每天经饮水供给50g葡萄糖。在试验期用漏斗形强饲器向嗉囊中强饲(Precision-feeding)50g被测饲料,用塑料瓶定量收集排泄物48小时。两次试验间隔10天。内源氨基酸排泄量通过饲喂50g无氮日粮测定。排泄物的收集与处理:强饲后分别收集每只鸡48小时的排泄物,每日收集4次。将每只鸡的排泄物对应地放到已称重的不锈钢盒内,60℃鼓风干燥。置室内回潮24小时,称重,记录,粉碎,过60目筛再将排泄物混合均匀,装瓶封存。立即分析样品干物质含量,并计算每个重复组鸡的平均排泄物量(克/只/48小时);若不能即刻进行氨基酸分析,测定氨基酸含量时须再次测定样品干物质含量,以便准确计算排泄物中氨基酸含量。饲料和排泄物中的氨基酸(AA)含量用HPLC-FMOC法测定。真可消化氨基酸含量(绝干物质基础上)=样品氨基酸量×氨基酸真消化率(TAAD)/样品干物质1.3定标和检验方法近红外光谱分析仪为Percon公司生产的PERCONINFRAMATIC8620近红外仪,为滤光片型,具有20个滤光片,扫描1445~2345nm范围内的近红外光谱区。外部与长城286微机联机,配有PerconNIR3.37版本的定标软件,可实现样品原始光谱的搜集、自动滤光片的选择、数据分析、多元回归等功能,建立定标方程;并可对定标方程进行检验。在制作定标方程的过程中,首先用体内法测定定标和预测样品的氨基酸真消化率。所有进行定标和检验样品在扫描光谱前粉碎,并通过1mm孔径的筛。扫描前,样品需在NIRS样品室中恒温至23℃。扫描的光谱值将与实验中得到的氨基酸消化率及氨基酸含量值对应起来,通过多元回归建立定标方程。定标样品的选择采用定标程序中的样品筛选程序,它以主成分分析方式描述样品数量,以数量形式分离出具有与样品平均值相似或不相似光谱的样品。每种样品的每个指标分别按各自的含量范围筛选样品进行定标,并用未参与定标的一组样品对定标方程进行检验。真实值和预测值之间的差异作为预测误差(SEP),SEP是检验预测效果的尺度。变异系数(CV)在10%以内的定标是可以接受的。定标样品的筛选原则根据产地、含量梯度以及光谱特性进行筛选。每个氨基酸定标时采用不同的定标样品,运用定标程序中的标样筛选程序从数据集选择定标样品,其他样品作为检验样品。在定标的过程中再删除一些差异大的样品,所以不同氨基酸的定标样品数不同,用于检验的样品数也有差异。1.4衍生、大样本量消化管水解模型本实验采用的方法是HPLC荧光检测、FMOC荧光衍生剂衍生、大样本量消化管水解和加内标(Taurine,牛磺酸)校正相结合,此分析方法的灵敏度值和回收率均高。氧化水解测定含硫氨基酸,碱水解测定色氨酸,酸水解测定其它氨基酸。2试验结果2.1棉籽粕的氨基酸用量表2、3列出了棉籽粕真可消化氨基酸的定标方程及检验参数。除胱氨酸外,其它氨基酸的定标方程效果良好。色氨酸定标方程和检验样品的相关系数都在0.90以上,说明用NIRS进行定标是可行的,但变异系数在10%左右,需进一步提高它的精度。由于棉籽粕含有棉酚且其消化率低、使它在饲料配方中的使用中受到限制。如果用真可消化氨基酸进行配方,可提高棉籽粕在配合料中的用量,降低饲料成本,从而有效地利用这种非常规的饲料资源。用一组未参与定标的样品对棉籽粕真可消化氨基酸NIRS定标方程进行检验,检验结果见表3。2.2基于线性范围和方法的学习表4、5列出了菜籽粕的定标方程及预测的参数结果。除赖氨酸外,其它真可消化氨基酸都获得了成功的预测效果。由于赖氨酸定标和检验的变异系数都大于10%,还不能进行实际的应用,但相关系数经F检验达到了极显著的水平,说明通过控制影响其精度的因素可提高预测精度。赖氨酸变异系数大的原因可能与体内法的变异有关,因此NIRS预测值的变异也大。用一组未参与定标的样品对菜籽粕真可消化氨基酸NIRS定标方程进行检验,检验结果见表5。3实验设计和定标方法棉籽粕和菜籽粕的总含硫氨基酸的定标结果好于单个的含硫氨基酸。Jackson(1996)的研究结果与此类似。似乎NIRS更适合估测总含硫氨基酸,这可弥补NIRS预测胱氨酸和蛋氨酸效果差的不足。棉籽粕和菜籽粕色氨酸的定标和检验效果不如其它氨基酸好,其精度需进一步提高。个别氨基酸定标效果稍差的原因与样品中氨基酸的含量低有关一方面是含量低进行化学法测定时误差大,造成化学法测值的不准确;另一方面氨基酸含量低时,NIRS分辨度低,易产生较大误差。从总的趋势来说,氨基酸含量高的,定标的相关系数比较高,变异系数小;而氨基酸含量低的,定标的相关系数比较小,变异系数相对比较大。因NIRS的准确性依赖于常规分析的准确性,所以常规分析一定要准确,才能获得好的定标方程。棉籽粕除胱氨酸和色氨酸,菜籽粕除赖氨酸外,其它氨基酸的变异系数都在7%以下。Jackson(1996)认为变异系数在10%以下是可以接受的。棉籽粕除蛋氨酸、胱氨酸、丙氨酸和色氨酸外,其它氨基酸的定标都获得了好的定标效果。菜籽粕总含硫氨基酸和总氨基酸获得了好的定标效果,而赖氨酸和色氨酸的定标效果经检验精度稍差,需添加样品进一步提高它预测的精度或单独建立以赖氨酸或色氨酸为主的不同精度含量的样本实体单独定标。另外,在某些情况下NIRS预测方程反过来又可验证化学法测值的疏漏,检出差异大的样品送回实验室进行核实为开发有效的定标方程,定标数据集应包括最大量的含有各种变异的样品。为了能进行实际应用,至少要用100个不同样品用于开发定标方程。这些样品必须能代表将要预测的样本,样品应取自事先确定的服务对象,如不同加工年份和划定的加工工艺及主要品种。定标的有效性可用定标检验程序检验。检验样品最好能覆盖将来要预测的样品的范围。所有样品先用待检验的定标方程预测,而后用常规方法化验得到实测值。由预测值和实测值间的差异可得到预测标准差,这是衡量定标精确性的尺度。然而,开发定标方程的工作成本高且繁锁。一次定标包括所有变异的样品是不可能的。为此,用包含一定变异范围的样品开发出定标方程经检验精度达到要求后,通过实际检验,用预测值与实验室值交互验证,当积累到一定数量时,可重新定标,扩大NIRS的预测范围,提高定标的精度。4定标结果的应用从本研究可以看出,近红外预测棉籽粕和菜籽粕真可利用氨基酸含量的定标结果是可行的,它为饲料工业提供了一种简单、快速、相对准确的测定真可利用氨基酸含量的方法