突触素在balbc和c57bl6小鼠海马各组分中的表达

突触素在balbc和c57bl6小鼠海马各组分中的表达

balb.c和cs7bl。6是实验中常见的动物，它们属于附近的交系。由于Balb/c和C57BL/6小鼠体积小,繁殖快,基因组与人类基因组的同源性较高,所以被广泛用作肿瘤、免疫以及神经精神疾病的模式生物。近年来,许多研究发现它们在学习记忆和情绪等方面等神经行为学有各自特点。如在水迷宫训练中,C57BL/6小鼠的学习记忆能力强于Balb/c小鼠;在开场实验中,Balb/c小鼠表现出更多焦虑行为;而在洞板试验中,C57BL/6则表现更为焦虑。Balb/c和C57BL/6小鼠的行为学差异可能与它们神经解剖和化学递质水平不同相关,但是未见有研究报道这两种品系小鼠的海马突触素(synaptophysin)表达的差异。2013年1—6月,本研究通过免疫组织化学染色方法,观察和比较C57BL/6和Balb/c这两种小鼠海马中突触素表达的差异,为阐明这两个品系的行为学差异提供研究基础。1材料和方法1.1实验动物及设备健康8周龄的C57BL/6雄性小鼠(体重20~25g)和Balb/c雄性小鼠(体重22~25g)各10只,SPF级,由广东省医学实验动物中心提供。室温保持在20~25℃,湿度为60%~70%,自然采光,自由进食饮水。1.2开颅大树叶片的4.3小鼠用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,快速开胸,经左心室插管到升主动脉,快速灌注室温生理盐水约50mL冲洗血管后,继续灌注4℃的4%多聚甲醛充分固定。开颅取脑,在4%多聚甲醛4℃过夜之后,相继置于10%、20%和30%蔗糖缓冲液中4℃保存至脑沉底。按照小鼠脑图谱(PaxinosGandFranklinKBJ,2ndedition),使用冰冻切片机(德国莱卡CM1950),从Bregma-1.84mm至Bregma-2.80mm做连续冠状切片,片厚30μm,每隔5张取1张。1.3抗鼠触变体抗体的制备将小鼠大脑的冰冻切片挑出转移至盛有PBS的12孔板中,首先用3%过氧化氢溶液漂洗封闭过氧化物酶,再用10%胎牛血清封闭液在室温下孵育30min,封闭非特异性显色。然后,在孔中加入兔抗鼠突触素IgG抗体(1∶400,Abcam),4℃孵育过夜。再用PBST漂洗3~5遍,5min/次之后,加入与生物素结合的羊抗兔IgG(1∶100,福建迈新生物技术开发有限公司)室温下孵育2h。最后用PBS漂洗3~5次后进行常规DAB显色,脱水透明和封片。阴性对照组不加一抗,其余步骤相同。1.4不同区域的生物图像分析使用尼康80i正置研究生物显微镜和JD-801形态学图像分析系统采集图像并进行分析。首先,在低倍镜下(×40)拍摄完整的海马结构,然后在高倍镜下(×100以及×200)拍摄海马各区域层次。采用生物图像分析系统对突触素的免疫反应产物进行定量分析统计。图片的染色强度通过图像数字化转换输出作为分析指标,以平均光密度值代表免疫组织化学染色的强度作为观察指标。在摄片预先设定显微镜的参数值,以确保对所有分析的片子无偏移。这些亚区内所分析的层均为手动确定。图像分析采用双盲法,分析人员不知实验分组情况,在高倍镜(×200)下观察突触素在不同品系小鼠海马分区中各亚层内的表达。1.5统计方法2结果2.1突变素在“7bl/6小鼠海马ca1区stratum、ssraet、腔隙分子层中的表达强度在阴性对照中,未见明显的突触素免疫组织化学染色。在C57BL/6和Balb/c小鼠脑切片中,可见突触素在海马结构各区广泛表达,见图1。突触素表达在C57BL/6和Balb/c小鼠海马CA1区的起始层(stratumorience)、锥体细胞层(stratumpyramidale)和腔隙分子层(stratumlacunosum-moleculare),其中在锥体细胞层的表达最强烈,见图2。统计结果显示,突触素在C57BL/6小鼠海马CA1区锥体细胞层的表达强度高于在Balb/c小鼠相同区域的表达强度(P<0.05);突触素在C57BL/6与Balb/c小鼠海马CA1区的起始层和腔隙分子层中的表达强度差异无统计学意义(P>0.05);突触素在两种小鼠海马CA2区各亚层中的表达与其在CA1区中的表达相似。见表1。2.2突变素在小鼠海马ca3区锥体细胞层表达强度的变化突触素在C57BL/6和Balb/c小鼠海马CA3区的起始层、锥体细胞层、透明层和放射层中均有表达,在锥体细胞层分布最为密集,在放射层呈明显的中空树枝样分支,见图3。统计结果显示,突触素在Balb/c小鼠海马CA3区锥体细胞层的表达强度高于在C57BL/6小鼠相同区域的表达强度(P<0.05);突触素在C57BL/6与Balb/c小鼠海马CA3区起始层、透明层和放射层中的表达强度比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。2.3两个马蹄形动物的特征是co4区域和牙齿形状的回归突触素在C57BL/6与Balb/c小鼠海马CA4区和齿状回中的表达强度差异无统计学意义(P>0.05),见表1和图4、5。3不同大小海马ca1区和ca3区突变素的表达水平尽管Balb/c和C57BL/6小鼠同属于近交系小鼠,但它们的神经行为学有很大的差异。在不同实验环境中,Balb/c和C57BL/6小鼠的学习能力和情绪调控的差异也不同。在水迷宫训练中,Balb/c小鼠不会随着每次训练而减少潜伏期的时间。然而,YOSHIDA等的研究发现,在去除水的因素,Balb/c小鼠的定位能力与C57BL/6小鼠相比差异无统计学意义。在开场实验和早期母子分离等应激条件下,Balb/c小鼠比C57BL/6小鼠更加焦虑和恐惧程度明显提高。MICHALIKOVA等的研究进一发现Balb/c小鼠与C57BL/6小鼠在有保护因素的开场实验中,焦虑程度差异并无统计学意义。海马是参与学习记忆和情绪调控等功能的重要脑区。在冠状切面上,海马由相互联系的CA1-CA3、CA4和齿状回等多个区域组成。突触素是构成突触囊泡重要蛋白,特异性分布于突触前囊泡上,参与神经递质的释放和突触囊泡的循环,是突触发生和突触可塑性的重要标志。在人和大鼠的研究中发现,海马CA1区和CA3区突触素的表达水平与学习、记忆和情绪等密切相关:突触素表达水平越高,学习和记忆能力越强;反之,则相反。Balb/c和C57BL/6小鼠海马区神经环路和神经递质代谢的差异可能是这两个品系小鼠神经行为学不同的基础。既往研究发现,与C57BL/6小鼠相比,Balb/c小鼠海马齿状回苔藓纤维长度短,颗粒细胞体积小,乙酰胆碱的代谢率高。本研究进一步发现突触素在Balb/c与C57BL/6小鼠海马CA1区和CA3区锥体细胞层的表达存在差异:与C57BL/6小鼠相比,Balb/c小鼠海马CA1区锥体细胞层突触素表达强度较低,而海马CA3区的锥体细胞层突触素表达强度较高。在空间学习记忆的过程中,海马CA1区和CA3区均发挥了重要的作用,但仍有一些区别。单独损伤海马CA3区不影响实验大鼠在传统Morris水迷宫测试中的表现,但影响其在延迟匹配位置的水迷宫表现;而单独CA1区损伤则导致大鼠在上述两种水迷宫中的表现均下降。这可能与CA1区和CA3区锥体细胞的特性,以及它们与其他脑区的神经联系不同相关。CA1区含小锥体细胞,其中10%为中间神经元。CA3区锥体细胞比较大。在海马内环路中,齿状回中颗粒细胞发出苔状纤维主要投射至CA3区,而CA3区锥体细胞发出Schaffer侧支则投射至CA1区锥体细胞。在海马外的神经环路中,隔核、斜角带核以及下丘脑后核的胆碱能神经元主要投射至海马CA3区,而丘脑前核与邻近的外侧背核以及中线核神经纤维主要投射至CA1区。既往许多研究都表明在Morris水迷宫测试中,C57BL/6小鼠的学习能力比Balb/c小鼠强,结合海马CA1区在Morris水迷宫中的重要作用,本研究结果提示C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠海马CA1区和CA3区突触素表达水平可能与种属的行为学差异相关。除了海马,脑的很多其他区域