大鼠足三里穴镇痛作用的观察

大鼠足三里穴镇痛作用的观察

针灸和艾灸是一种有效的针灸和艾灸疗法。然而,穴位作为针刺诊疗的反应点和刺激点,其实质和作用机制仍然不很明确。目前已经有研究者开始探索穴位、经络与结缔组织的关系,他们认为,在行针过程中,提插捻转等手法的运用会引起针体周围组织牵拉,引起细胞水平的信号循经传导,并形成特异性通路,从而产生疗效。也有研究者通过磁共振成像(MRI)、解剖和X射线计算机断层扫描(XCT)进行穴位形态学定位,认为人体经络穴位是以结缔组织为基础的复杂体系。肥大细胞作为人体疏松结缔组织内一种常见的细胞,早在上世纪80年代起就有研究者予以了关注,提出针刺得气感传与局部肥大细胞相关的假说。此后相继有研究表明,人体和大鼠体内一些主要穴位肥大细胞数量较非穴区多,肥大细胞多沿经线走行方向上的小血管、神经囊分布;其低电阻线全程皮肤各层中的肥大细胞数也明显多于对照区。针刺则通过力学刺激引起穴位局部肥大细胞脱颗粒,并促使其释放介质。这些介质具有多种作用,其中如组织胺能扩张毛细血管及微静脉,它作用于血管内皮使基底膜暴露,组织液渗出,以致沿经络线上局部组织发生电位变化。本文旨在观察穴位肥大细胞功能与针刺镇痛作用之间的关系。1材料和方法1.1针刺治疗环境标准SD大鼠,由中国科学院上海实验动物中心提供,共48只,雌雄各半,体重(200±20)g。所有大鼠在同等标准环境(GB14925-2001)内饲育和使用,给以自然照明、自然饮水和饮食。随机分为8组,每组6只,分别为正常对照组、穴位针刺组、旁开针刺组、色甘酸钠注射组、生理盐水注射组、色甘酸钠注射+针刺组、生理盐水注射+针刺组以及色甘酸钠注射+对侧针刺组。所有实验方法经上海市针灸经络研究中心实验动物伦理委员会通过。1.2基础痛阈测定该实验是用从一定温度开始升高的辐射热刺激大鼠尾部,通过测量甩尾潜伏期来检测伤害性反应的敏感度。采用IITC336爪/尾测痛仪(美国IITC)进行热刺激,每次以40%光强度刺激大鼠尾部离尾尖2cm且面积为2mm×2mm的皮肤。实验环境温度控制在(22±1)℃。设置最长刺激时间为20s,以防止大鼠的组织损伤。测试前将大鼠安置在固定器内适应10min,然后连续测量3次甩尾潜伏期,取平均值作为基础痛阈(每次测量间隔5min)。测量基础痛阈后10min开始实验操作。1.3血清学检测大鼠痛阈变化根据足三里穴具有较强的镇痛效应,选取该穴为实验用穴。参照《实验针灸学》中常用实验动物针灸穴位附图定位(腓骨小头下方5mm处)。将大鼠单侧后肢膝关节外下方,即腓骨小头下方体毛除去,用28号1寸毫针针刺单侧“足三里”穴。选取“足三里”穴左侧旁开3mm处作为旁开对照针刺点。毫针直刺深度约为7mm,每隔5min进行提插和捻转。手针持续时间30min,每隔5min观测大鼠痛阈变化。为使手针的刺激定量化,我们使用了一套自制临床针灸针体实时受力监测系统用于同步观察与记录针刺过程中针体的受力情况(提插和扭转),并以此作为针刺强度与频率的定量化指标。1.4丰隆穴注射a组研究表明,色甘酸钠是肥大细胞膜稳定剂,能抑制其释放介质。用蒸馏水配成色甘酸钠(Sigma公司进口分析纯产品)溶液进行穴位注射,注射剂量参照《实验针灸学》附录六“实验动物与人用药量的换算方法”得出(每次注射色甘酸钠溶液约为20μL,色甘酸钠溶液浓度为0.02g/mL)。选用标准微升注射器将稳定剂在穴位处局部给药,然后比较色甘酸钠注射前后针刺大鼠“足三里”镇痛作用差异,并以生理盐水注射作为对照。1.5各组大鼠穴位处组织切片的制备正常对照组、穴位针刺组、色甘酸钠注射+针刺组及生理盐水注射+针刺组大鼠经1%戊巴比妥钠1mg/kg腹腔注射麻醉并断头处死,取各组穴位处体积约为3mm×3mm×3mm的组织块标本,经4℃固定液中固定48h后将组织脱水石蜡包埋,制作连续切片(片厚4μm),切片方向为皮肤、肌肉组织块纵切面。皮肤采用0.5%甲苯胺蓝(ToluidineBlue,TB)染色,肌肉采用中性红(NeutralRed,NR)染色,常规脱水、透明后封片。10×20倍光镜下观察切片肥大细胞形态并计数,40倍镜下拍摄光镜照片。1.6大鼠肥大细胞计数及脱颗粒率的计算测量并比较肥大细胞稳定剂注射前后针刺对大鼠痛阈的影响,计算大鼠痛阈变化率:痛阈变化率=(甩尾潜伏期-基础痛阈)/基础痛阈×100%。比较各组计数野内肥大细胞数量和脱颗粒率。每只大鼠取5张切片,每张切片观察4个视野,分别记录每个视野的肥大细胞总数及其中脱颗粒细胞数,脱颗粒率=脱颗粒细胞数/肥大细胞总数,取平均数作为该大鼠穴位处组织脱颗粒率。所得数据经方差齐性检验后,用单因素方差分析做统计学处理。实验结果以平均值±标准差(x—±s)(x—±s)表示,所有数据用SPSS10.0统计软件包处理。2结果2.1压监测和控制我们采用自行研发的临床针刺针体实时受力定量监测系统观察到穴位处针体受力情况。如图1所示,通过对针体上提插力和捻转扭矩的观察和控制,使得每次刺激的强度和频率保持在一定范围。对于大鼠“足三里”穴,针体提插受力在240-280mN,扭矩在10-15mN·mm,频率为3次/s。2.2针刺后痛阈总效果通过观察如图2所示的30min内手针“足三里”穴对于大鼠痛阈影响的时效变化,我们发现针刺后大鼠痛阈缓慢升高,一般在针刺后20min达到最高点,与正常对照组相比痛阈变化率超过13%,甩尾温度平均提高3.5℃以上。针刺20-25min期间痛阈保持高水平,25-30min期间痛阈缓慢回降,在拔针后痛阈继续回降,拔针后10min尚未恢复到基础痛阈。在旁开对照点进行相同强度的针刺时,在整个行针过程中,大鼠痛阈提高率始终不如“足三里”穴的效果。由此可以看出,在同样刺激条件下,针刺“足三里”穴产生的镇痛效果在各个时刻都要高于针刺旁开对照点。2.3色甘酸钠对大鼠痛阈的影响根据注射对痛阈的影响实验结果,我们选择在注射完毕20min后对大鼠开始进行针刺。为保持统一,基础痛阈仍选用注射前的甩尾潜伏期平均值。通过图3和表1我们可以看出,在色甘酸钠的作用下,针刺对大鼠痛阈的影响被明显削弱。对比注射色甘酸钠与注射生理盐水两种情况下针刺20min的痛阈变化率,注射色甘酸钠后变化率比注射前平均值下降了5.43%,而生理盐水注射使其下降2.67%,在注射色甘酸钠的对侧穴位针刺使其下降2.25%。提示3种注射对针刺提高痛阈的效应都有不同程度的削弱,其中在注射色甘酸钠的情况下对针刺同侧穴位效应的抑制作用尤为明显。2.4穴位针刺对穴区肥大细胞的影响在组织染色切片中我们可以观察到,正常对照组肥大细胞呈球形或棱长形,细胞膜完整,胞浆内充满异染性颗粒(皮肤组织用TB染色法,颗粒呈紫红色;肌肉组织用NR染色法,颗粒呈石榴红色),如图4a、b(箭头处)。穴位针刺组穴区肥大细胞的脱颗粒率明显提高,细胞膜相对变薄并产生破裂,大量的脱出颗粒散在组织间,细胞周围有数量不等的异染性颗粒,如图4c、d(箭头处)。而在色甘酸钠作用后,针刺未能明显促使穴区的肥大细胞发生脱颗粒,肥大细胞形态与正常对照组相似,如图4e、f(箭头处)。针刺后穴位处皮肤及肌肉组织中的肥大细胞脱颗粒率都显著高于正常对照组,而穴位注射色甘酸钠能抑制这种现象,统计数据见表2。3穴位区肥大细胞脱颗粒的作用本文首次通过抑制穴区肥大细胞脱颗粒功能的实验来观察穴位区肥大细胞在针刺效应中所起的作用。通过对各组别大鼠在30min行针过程中甩尾潜伏期的测量,我们发现,手针大鼠“足三里”穴具有显著性的镇痛作用,在相同的刺激强度下,镇痛效果明显优于针刺旁开对照点;而在色甘酸钠的作用下,这种镇痛作用被明显地削弱。通过组织切片染色观察可看到,针刺后穴位处局部肥大细胞脱颗粒率显著提高;而穴区注射色甘酸钠可以明显减少脱颗粒率,同时也显著地降低了针刺镇痛效应。这表明穴位区肥大细胞参与了针刺效应,而肥大细胞的脱颗粒现象是产生针刺效应的一个重要环节。通过以上实验和研究结果,我们可以了解到结缔组织中的肥大细胞在穴位处丰富密集分布的特点,作为人体疏松结缔组织内一种常见细胞,它和周围的血管、神经丛、淋巴管等交织而成一个复杂体系,从而构成穴位的物质基础。结缔组织中的肥大细胞活化后能够释放颗粒及其所含的活性物质,这些活性物质不但影响到神经末梢的兴奋性,而且还会影响到血管的功能状态。已有研究表明,当针体在穴位处进行提插和捻转手法时,引起穴位处局部结缔组织纤维的缠绕;与此同时,针体则通过纤维向周边的细胞传递机械信号,其中包括短期内引起局部肥大细胞脱颗粒,并