固相微萃取制备黄茶香气的研究

固相微萃取制备黄茶香气的研究

香气是茶叶品质的一个重要因素，其对茶叶品质的贡献率为25%-40%。由于受茶树品种、生态环境和加工方法的影响,茶叶产品有着丰富多样的香型,如清香、粟香、甜香、花香、果香和陈香等。为了探讨各类茶叶香型的形成机理和内在化学本质,已应用气-质联用技术(GC-MS)对不同香型茶叶的香气物质种类和含量进行了大量研究,研究发现:茶叶香精油的制备方法显著影响其定性和定量结果,这主要由于茶叶香气组成复杂、含量低微、易挥发、不稳定,在香精油制备过程中易发生氧化、聚合、缩合、基团转移等反应。在早期的茶叶香气研究中,主要采用减压蒸馏法(vacuumdistillationextraction,VDE)和同时蒸馏萃取法(simultaneousdistillationextraction,SDE)捕集茶叶香气。但是VDE法所需样品量大,处理周期长,且对酯类物质的捕集效果较差;SDE法使茶叶样品长时间处于高温、高湿的环境,易使获得的香气物质组成及其比例发生变化,不能真实地反映样品中香气组分的实际构成。近年来,顶空固相微萃取(headspacesolidphasemicroextraction,HS-SPME)技术因具有所需样品量少、灵敏度高、重现性好、操作简单、方便快捷且不需有机溶剂的特点,逐渐将其应用于乌龙茶、普洱茶、绿茶和苦丁茶香气物质的捕集,但各研究报道在HS-SPME条件:萃取头类型、萃取温度、萃取时间和茶叶用量等方面存在较大的差异。黄茶是我国的六大茶类之一,其独特的“闷黄”工序和“先低后高”的干燥方式造就了黄茶特殊的“鲜甜”或“锅巴香”香型。但迄今为止,尚未见有关黄茶香气的研究报道。因此,本实验以自制的山东黄茶为试材,研究顶空固相微萃取捕集黄茶香气物质的影响因素,优化GC-MS分析条件,对山东黄茶香气组分进行定性和定量分析,旨在建立黄茶香气的HS-SPME-GC-MS分析方法,探明黄茶香气物质的组成特点。1材料和方法1.1黄小茶加工防蒸以2008年10月采摘泰山小津口茶园1芽1叶鲜叶为原料,按“摊放→蒸青→初烘→揉捻→闷黄→干燥”工艺加工成黄小茶。其产品经感官审评具有黄茶所特有的甜鲜香味。1.2聚二甲基硅氧烷聚二乙烯苯磺酸酯的合成GC-MS-QP2010Plus气相色谱-质谱联用仪日本岛津公司;Supelco固相微萃取装置美国Supelco公司;萃取头为键合型PDMS(polydimethylsiloxane,聚二甲硅氧烷,涂层厚度7μm)、非键合型PDMS(聚二甲硅氧烷,涂层厚度100μm)、PA(polyacrylate,聚丙烯酸酯,涂层厚度85μm)、复合DVB-CAR-PDMS(divinylbenzene-carboxen-polydimethylsiloxane,二乙烯苯-碳分子筛-聚二甲基硅氧烷共聚物,涂层厚度为50/30μm);HH-8型水浴锅国华电器有限公司;FA1004A型分析天平上海精天科贸有限公司。1.3方法1.3.1锡脂瓶内引导茶叶中锡银瓶内的挥发油回收将固相微萃取头在气相色谱仪的进样口经250℃老化30min备用;称取有代表性的黄茶10g,放入100mL的三角瓶内,用锡箔纸封口。首先将其置于80℃的恒温水浴锅内10min,使茶叶香气充分挥发和平衡;然后将固相微萃取装置的针头穿透锡箔纸插入三角瓶内茶叶上方,固定好固相微萃取的手柄,小心推出纤维头并开始计时;吸附60min后取出,随即插入GC-MS仪器的进样口,在230℃下热脱附1min。1.3.2柱前压温度GC条件:Rtx-5MS石英毛细管柱(30.0m×0.32mm,0.25μm)、载气He(99.999%)、柱前压4.07×104Pa、分流比5:1、进样口温度230℃、柱温为起始温度30℃保持3min、以2℃/min升至160℃、再以10℃/min升至230℃、保持3min。MS条件:电子轰击离子源(EI)、温度200℃、电子能量70eV、质量扫描范围35~450u、扫描速度909u/s、光电倍增管电压800V。1.3.3质谱条件的确定根据得到的总离子流图中各色谱峰的质谱信息,经NIST05标准质谱库对照及与已发表的茶叶香气质谱资料比较,确定各色谱峰对应的物质结构。各色谱峰的峰面积与总峰面积之比为各香气组分的相对含量。2结果与分析2.1固相固萃取条件的优化2.1.1不同萃取头捕集黄茶香气的类型,其萃取效果和分数对本实验所用的4种不同类型萃取头捕集的黄茶香气组分数(表1)进行比较分析可以看出:以DVB-CAR-PDMS(50/30μm,键合型)萃取头捕集的黄茶香气组分数最多,达128种,分别为PA(85μm,键合型)、PDMS(100μm,非键合型)和PDMS(7μm,键合型)3种萃取头捕集香气组分数的4.13、2.29倍和5.12倍。因此,在黄茶香气捕集时宜选用DVB-CAR-PDMS固相微萃取头。2.1.2半干法不同温度对香气组分数量和总峰面积的影响采用DVB-CAR-PDMS(50/30μm,键合型)萃取头,分别在40、50、60、70、80、90、100℃温度条件下进行黄茶香气物质的固相萃取,经GC-MS分析获得不同处理样品的香气组分数量和总峰面积,结果见图1。香气组分的数量在温度低于60℃时变化不大,当温度高于70℃时数量明显增加,由60℃时的58种增加至70℃时的89种,且增加组分的保留时间一般大于33min,即:随着温度的升高,高沸点的香气组分数量增加。不同吸附温度对香气总峰面积的影响呈现单峰曲线,当温度小于80℃时,总峰面积随温度的升高而增大,在80℃时达到最大值,随后随温度的升高而减小。综合以上结果,适宜的吸附温度为80℃。2.1.3固相萃取时间的确定在80℃下采用DVB-CAR-PDMS(50/30μm,键合型)萃取头,分别设置15、30、45、60、75、90min进行黄茶香气物质的固相萃取,经GC-MS分析获得不同处理样品的香气组分数量和总峰面积,结果见图2。在60min前,随着吸附时间的延长,香气的吸附量逐渐增加,60min后继续延长萃取时间,吸附量变化不大。这是因为吸附时间为60min时,黄茶中的香气物质吸附和解吸达到了动态平衡。并且,随着吸附时间的延长香气组分不断增加,说明吸附时间小于60min时,有些香气成分是由于吸附时间短导致吸附量过少而未被检出。因此,实验选择吸附时间为60min。2.1.4解吸历史时间茶叶香气物质解吸在高温下进行,而高温可能会使一些香气物质发生氧化、异构化等反应,因此在香气物质完全解吸的前提下,解吸时间越短越好。本实验设置解吸时间1、2min进行对比实验,分别检测出131种和130种香气组分,总峰面积分别为10.16×107和9.69×107,因此本实验解吸时间确定为1min。2.2酯类化合物检测应用优化的HS-SPME条件捕集黄茶香气物质,热脱附后进行GC-MS分析,共检出黄茶香气组分108种(表2和图3),其中烷烃的种类多(23种),含量高(14.649%),由含碳数9~21的烃类化合物构成,且主要为含碳数14、12和15的同分异构体;酯、醇、醛和酮类化合物通常具有清香或花果香味,是茶叶香气的主体部分,在黄茶中占香气种类的57.41%,含量62.20%,且主要以脂肪族化合物为主,芳香族和萜烯类化合物种类较少。如17种醛类化合物中有15种含碳5~14的脂肪族醛,仅有苯甲醛和苯乙醛两种芳香族醛,其含量仅占醛类总量的10%;17种醇类化合物中有11种含碳5~16脂肪族醇,仅有4种萜烯醇和2种芳香醇类;20种酯类化合物中有14种脂肪族酯类化合物,只有6种芳香族酯类化合物;8种酮类化合物中有6种脂肪族酮,仅有2种环酮化合物。此外,含氧化合物、含氮化合物和含硫化合物虽然其种类少,仅有2~4种,含量也较小,但对茶叶香气的贡献较大,如:含氮化合物中的吡嗪及其衍生物具有明显的烘烤香味,而且这些化合物有着极高的香气强度和极低的香气阈值,所以对香气的影响也极为重要,如2,5-二甲基吡嗪、2-正戊基呋喃。吲哚在稀浓度时有类似茉莉花的香气;但也有个别香气组分如咖啡碱无香气。在色谱图中,保留时间小于30.5min的香气组分主要以醛(14种)、醇(11种)和烃类(12种)为主,分别占此段香气物质总量的40.4%、33.7%和13.0%。其中醛类和醇类对香气的贡献较大,含量较高的醛类组分有:具果香的辛醛(1.56%)、壬醛(6.36%)、癸醛(1.01%),杏仁香的苯甲醛(1.03%),花香的苯乙醛(1.17%),此外还有在稀浓度下具清香的正己醛(2.55%)、庚醛(1.61%);含量较高的醇类组分有:具果香的苯甲醇(5.88%)、甜花香的2-乙基己醇(4.61%)、辛醇(1.31%)。在保留时间30.5~60min的香气组分主要以烃类(20种)、酯类(7种)和乙二硫醇为主,分别占此段香气物质总量的36.2%、30.2%和19.4%。烃类中含量较高的有:十四烷(3.296%)、(Z)-3-十六烯(2.09%)和1-甲基萘(1.074%);酯类含量高的有:具芳香的邻苯二甲酸二乙酯(7.73%),异戊氧基乙酸乙酯(2.086%)。保留时间大于60min的香气组分则以高级脂肪酸和邻苯二甲酸的酯类化合物为主,占此段香气组分总量的40.5%,其中仅有邻苯二甲酸二丁酯(0.549%)和邻苯二甲酸二丙酯(0.142%)对香气有贡献。3不同种类黄茶香气的固相微萃取3.1固相微萃取头是在一段细纤维表面上涂渍高表面积多孔聚合物材料的装置,其吸附强度主要取决于涂层材料的性质和厚度。目前用于茶叶香气分析的萃取头主要有单一涂层的PDMS、PA和DVB-CAR-PDMS,而以上萃取头因涂层的极性不同,对不同极性香气物质的吸附差异很大。根据“相似相溶”原理,非极性的PDMS萃取头对非极性香气物质吸附力较强,极性的PA萃取头对极性的香气物质吸附力较强,而DVB-CAR-PDMS因兼有极性和非极性涂层,所以吸附范围较广。这与茶叶香气组成复杂、各组分之间极性差异很大的特点相适应,所以,茶叶香气顶空固相萃取宜使用混合涂层的DVB-CAR-PDMS(50/30μm)萃取头,这样吸附的茶叶香气物质种类多,这与文献[18-19]的结果一致。3.2萃取温度不仅影响固相微萃取的香气吸附量,而且对茶叶香气分析的结果影响显著。在较低的萃取温度下,茶叶香气的挥发速度较慢,达到香气平衡所需时间较长,更为重要的是它将导致低沸点的茶叶香气所占比重增加,而高沸点香气的比重减小,从而影响分析结果的真实性;相反,在较高的萃取温度下,则可能使香气组分发生异构化或通过热裂解途径产生新的香气组分,同样影响分析结果的真实性。本实验结果表明:黄茶香气的最适萃取温度为80℃,其依据是此温度下所吸附的香气组分的总峰面积最大,但此温度显著高于目前文献报道的其他茶类(绿茶、乌龙茶和普洱茶)40、50、60℃的香气固相萃取温度[2,7,8,9,10,11,12,14]。为了评估80℃下进行固相微萃取对黄茶香气分析结果的影响,特对萃取容器中的黄茶香气进行感官审评,结果