木犀草素与抗菌药体外联用抗耐甲氧西林金葡菌的实验研究

木犀草素与抗菌药体外联用抗耐甲氧西林金葡菌的实验研究

黄酮类化合物属于黄酮类化合物，是植物中常见的天然色素成分。最初，它是通过分离和重视草科植物科的木槿草科植物。它的化学特征是3、4、5和7-4羟基黄酮。近年来的药理及Ⅰ期临床实验显示,木犀草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗辐射、降低血脂和胆固醇、心脏保护、免疫调节、利胆利尿等多重生物活性。随着对木犀草素的抗菌活性研究逐步深入,越来越多的学者发现木犀草素对多种菌株均有抑制作用。林卓慧的实验研究表明,木犀草素对枯草杆菌、大肠杆菌、金葡菌和啤酒酵母菌均有抑制作用,其最小抑菌浓度(MIC)为200～300mg·L-1。王秋安也报道称,一定浓度的木犀草素可抑制葡萄球菌、枯草杆菌、啤酒酵母、大肠杆菌、卡他菌、白色念珠菌、变形杆菌等的生长。王倩等还发现,木犀草素对金葡菌具有显著的抑制作用(MIC=90mg·L-1),其抑菌机制主要是,抑制DNA拓扑异构酶活性,进而影响菌体核酸及蛋白质的合成。临床实践表明,耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)仅对万古霉素等少数抗菌药物敏感,而对甲氧西林及其他临床常用抗菌药均耐药,具多重耐药性,且其感染多发生于免疫缺陷者、老弱患者、烧伤及手术患者,治疗难度大、病死率高,引起了广大医药研究者们的高度关注,故寻找高效、低毒的抗MRSA药物亦然迫在眉睫。国外有研究报道,木犀草素和与其结构类似的芹菜素均有抗MRSA活性。本文通过体外实验考察木犀草素与抗菌药联用抗MRSA的作用。1材料表面1.1木生长hplc法木犀草素,采用柱层析法从紫堇属植物金钩如意草(CorydalistaliensisFr.)中分离提取,并根据活性追踪的方法得到其活性单体,化学式为C15H10O6,相对分子质量为286.23,且其波谱与文献对照一致,确定为木犀草素,经HPLC处理后纯度达98%以上。注射用盐酸左氧氟沙星注射液(扬子江药业集团有限公司,批号:10020301);乳酸环丙沙星氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司,批号:1151020609);注射用硫酸阿米卡星(江苏吴中医药集团有限公司,批号:H19983021);注射用硫酸庆大霉素(广州白云山天心制药有限公司,批号:091020800);硫酸依替米星注射液(无锡济民可信山禾药业股份有限公司,批号:H19991423)。各种抗菌药药敏纸片(北京天坛药物生物技术开发公司,国食药监械(准)字2007第3400861号)。1.2m-h制备培养基水解酪蛋白(M-H)琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司,批号:091104);M-H肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司,批号:20100413);二甲基亚砜(DMSO,天津化学试剂有限公司,批号:20070924)。1.3重症患者痰液标本检测金葡菌ATCC25923耐药菌株:MRSA8、MRSA82、MRSA98、MRSA111、MRSA135、MRSA144、MRSA166、MRSA187、MRSA189和MRSA321,由成都军区昆明总医院药学部微生物室自呼吸科重症患者痰液标本中临床分离得到并鉴定。1.4精密机械系统SWCJIB型超净化工作台(苏州净化设备厂);PYX-DHS-4050型隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂);电热手提压力蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂);FA1004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);XW-80A型漩涡混合器(上海精科实业有限公司);TopPette型手动移液器(上海泱浩仪器有限公司);光学显微镜(日本OLYMPUS公司);冷藏柜(青岛海尔股份有限公司);96孔平底微量培养板(德国Greinerbio-one股份有限公司)。2方法2.1dmso对细菌的影响参照文献,采用倍比稀释法测定:依据打孔法得到的结果,并查阅相关文献,估算出测定药物MIC时首列孔中药物质量浓度,计算所需药物量;将药物用不超过溶液总体积30%的DMSO溶解,加入适量培养液,用震荡器混匀,配成药液;在培养板上,每孔加入100μLM-H肉汤培养基,并于首列孔中加入100μL药液,混匀,在此后各列孔中依次倍比稀释,吸出并弃去最后一列孔中稀释的液体100μL(以保证每孔液量一致),然后每孔加入菌液100μL;另设阴性对照孔(只加培养液)、阳性对照孔(菌液+培养液)以及DMSO对照孔(DMSO+菌液,以观察DMSO对细菌的影响);随后将培养板置于35℃恒温箱中培养18～24h,取出,肉眼观察各孔液体,清澈透明者视为无菌生长(实验前各孔液体清亮透明),不澄清者则涂片后在显微镜下加以观察,无菌生长的含药培养孔中最低药物浓度即为药物的MIC。2.2纸法实验2.2.1灭菌、制备取101定性滤纸,用打孔机制成直径为6mm的圆型小纸片,放入干燥洁净的小药盒中,于121℃高压灭菌15min,备用。纸片含药量根据MIC来确定,即将木犀草素用DMSO溶解并配成质量浓度为MIC的药液,加于灭菌纸片上,制得木犀草素纸片。2.2.2木瞳草素纸片与抗菌药药敏纸片联用抑菌效果观察将配好的菌液均匀地划线于整个M-H培养皿上,再将制备的木犀草素纸片与抗菌药药敏纸片两两相隔约3cm距离均匀地贴上,置于恒温箱里培养18～24h,观察记录两药联用的抑菌效果。2.2.3耐药菌株鉴定将临床分离得到的金葡菌菌株按常法增菌培养,采用美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的2007版抗菌药药敏常规测试方法(K-B纸片法)考察其耐药性,并依据CLSI颁布的2007版抗菌药物敏感试验执行标准推荐的头孢西丁药敏纸片操作方法及判定准则进行耐药菌株鉴定:抑菌圈直径小于或等于19mm,受试菌株即为MRSA,而抑菌圈直径大于或等于20mm,受试菌株即为甲氧西林敏感菌(MSSA)。2.2.4药敏试验结果采用K-B纸片法,受试菌株为MRSA,培养基为M-H琼脂培养基,培养温度为35℃,培养时间为16～24h,以CLSI推荐的抗菌药药敏纸片法判断标准评价受试菌株对药物的敏感性。如MRSA菌株对左氧氟沙星纸片的药敏判断标准为:含药纸片(5μg/片)的抑菌圈直径小于或等于15mm判定为耐药,16～18mm判定为中介(即介于耐药与敏感之间),大于或等于19mm判定为敏感。结果见表1。2.3体外药效学相互作用将联用的两种药物(A药和B药)置于96孔平底微量培养板上,以二维棋盘的纵向(A至H)和横向(l至12)两个方向分别进行倍比稀释,即根据所测定的两药单用时对受试菌株的MIC(分别记作MICa和MICb),将两药各自以4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和l/16MIC的浓度分别联用,然后加入菌液,考察每一种药物联用时的MIC(分别记作MICA和MICB),并通过计算部分抑菌浓度指数(fractionalinhibitoryconcentrationidex,FICI,FICI=MICA/MICa+MICB/MICb)来判断两药体外药效学相互作用:FICI≤0.5时,判定两药作用为协同;0.5<FICI≤1时,两药作用为相加;1<FICI≤2时,两药作用为无关;FICI>2时,两药作用为拮抗。2.4抗菌药物联用的抑菌效果测定以微量棋盘稀释法实验结果作为参考,进一步验证木犀草素与抗菌药物联用时对MRSA菌株的抑菌效果。用接种环挑取4℃保存的MRSA187菌落少许,接种于无菌M-H琼脂培养基平面上,于35℃恒温箱中培养24h活化后,用0.9%无菌生理盐水进行稀释,于涡旋振荡器上震荡15s,调整菌悬液浓度至1.0×106CFU·mL-1;将此菌液加入分别含有单一木犀草素和单一抗菌药物以及木犀草素与抗菌药物两两混合培养液的试管中,使菌悬液浓度为5×105CFU·mL-1,各药的终浓度为其MIC,并设只含细菌的肉汤培养液对照管,将各管置于35℃恒温箱中培养,分别于0、4、8、12、24h吸取培养液,并用0.9%无菌生理盐水进行不同倍数的稀释后,接种于无菌M-H琼脂培养基平面上,置于35℃恒温箱中培养24h,然后进行菌落计数,平行试验3次,取平均值,以log10CFU·mL-1对时间作曲线(即时间-杀菌曲线)。联用抑菌效果的判断标准为:药物联用组的菌落浓度对数值较两药单用组均降低超过2log10CFU·mL-1时,则判联用具协同效果;降低1～2log10CFU·mL-1时,则判联用具相加效果。3结果3.1药敏纸片法试验按“2.2.2”项下方法,选取4株MRSA配成菌液,选用15种抗菌药药敏纸片与木犀草素纸片进行双纸片法试验,初步考察木犀草素与15种抗菌药两两联用的抑菌效果。结果发现,木犀草素与喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药联用的抑菌效果较好(见表2)。3.2联用实验结果根据双纸片法试验结果,选用具有协同作用的木犀草素分别与左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星和依替米星的两两组合,按“2.3”项下方法,通过微量棋盘稀释法实验计算FICI,进一步考察并验证这些组合在不同浓度下联用的协同效果,结果见表3。由表3可见,木犀草素与左氧氟沙星联用时,对3株MRSA有协同抑菌作用,且左氧氟沙星的MIC可降至单用时的1/2～1/8;与环丙沙星联用时,对3株菌显示协同作用,环丙沙星的MIC也均可降至单用时的1/2～1/16;与庆大霉素联用时,对5株菌呈现协同作用,庆大霉素的MIC同样也可降至单用时的1/2～1/16;与阿米卡星联用时,对6株菌表现出协同作用,阿米卡星的MIC最低可降至单用时的1/4;与依替米星联用时,对6株菌显现协同作用,而对其他菌株则表现为相加作用,依替米星的MIC也能降至单用时的1/2～1/4。这进一步证实,木犀草素与喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药联用具良好的协同抑菌作用。(续表3)3.3菌落浓度对数值的影响按“2.4”项下方法,绘制木犀草素分别与左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星和依替米星两两联用的时间-杀菌曲线(见图1)。由图1可见,在各时间点,木犀草素与各抗菌药联用组的菌落浓度对数值均明显低于其相应单用组,尤以12和24h时最明显:木犀草素和左氧氟沙星联用组菌落浓度对数值在24h时较两药单用组分别降低了2.099和1.523log10CFU·mL-1,降幅最大;木犀草素和环丙沙星联用组菌落浓度对数值在12h时较两药单用组分别降低了1.415和2.235log10CFU·mL-1,降幅最大;木犀草素和庆大霉素联用组菌落浓度对数值在24h时较两药单用组分别降低了1.909和1.516log10CFU·mL-1,降幅最大;木犀草素和阿米卡星联用组菌落浓度对数值在24h时较两药单用组分别降低了1.706和1.539log10CFU·mL-1,降幅最大;木犀草素和依替米星联用组菌落浓度对数值在24h时较两药单用组分别降低了2.447和为2.106log10CFU·mL-1,降幅最大。这表明,5种抗菌药与木犀草素联用具一定的协同或相加作用,其与木犀草素产生协同作用由强至弱的顺序依次为:环丙沙星>依替米星>阿米卡星>左氧氟沙星>庆大霉素。4木瞳草素联合其他抗菌药的联合应用临床上在