红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的高效表达质粒的构建与纯化

红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的高效表达质粒的构建与纯化

卵石是大多数用于研究抗逆反应的药物。特别是卵白蛋白吸附的乳胶颗粒,作为一种外源颗粒抗原,能被专职性抗原递呈细胞交叉递呈。在以往抗原交叉递呈研究中,为示踪此蛋白在抗原递呈细胞中转运,常使用异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC)标记的OVA,但由于FITC标记的OVA为化学荧光分子交联的蛋白质,荧光强弱不能真实反映外源蛋白的降解情况。我们拟构建dsRed与OVA表位融合蛋白的表达质粒,并表达和纯化此蛋白。dsRed蛋白是一种来源珊瑚的红色荧光蛋白,OVA257-264表位是MHCⅠ类分子H-2Kb限制性的免疫显性表位,通过检测此表位的递呈,可进一步分析研究外源抗原在抗原交叉递呈中的转运和降解。1材料和方法1.1时代公司的表达质粒:pet-16b和pds水生植物克隆菌为大肠杆菌XL1-Blue为本室保存,表达菌为大肠杆菌BL21(DE3)购自天为时代公司,表达质粒:pET-16b购自美国Novagen公司,pIVEX2.4a购自美国Roche公司,pdsRed-C1为本校生化教研室周度金教授馈赠。1.2实验用质粒及试剂限制性内切酶NotⅠ、BamHⅠ、AgeⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ购自NewEnglandBioLabs公司,T4DNA连接酶购自Promega公司,小量质粒纯化抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司,DNA分子量标准DNALadder购自NewEnglandBioLabs公司,抗6×组氨酸抗体和ECLSystemforWesternBlot购自Roche公司,Ni2+-NTA琼脂糖填料为Qiagen公司产品,寡聚核甘酸的合成和重组质粒测序由上海申友生物技术公司完成,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺为Sigma公司产品。1.3tgaaactagcag、gactctagcag、gactctagcag10μLddH2O溶解1个OD合成寡聚核甘酸(ggccgcagtataatcaactttgaaaaactgggaccggtcgccag和gatcctggcgaccggtcccagtttttcaaagttgattatactgc),2条链各取2μL,加入10×T4连接Buffer2μL,加水至20μL,沸水浴中煮沸5min后置于室温,使之缓慢降温退火。1.4重组子的鉴定2μL变性退火寡聚核甘酸与NotⅠ-BamHⅠ酶切的pIVEX2.4a载体连接,AgeⅠ酶切鉴定重组子,命名为pIVEX2.4aOVA。随后pdsRed-C1的AgeⅠ-BamHⅠ酶切片段与同样酶切的pIVEX2.4aOVA连接,鉴定重组子命名为pIVEX2.4aOR。最后pIVEX2.4aOR的XhoⅠ-XbaⅠ酶切片段与同样酶切的pET16b连接,鉴定重组子命名为pET16bOR。重组子送上海申友生物技术公司,以T7启动子测序引物测序鉴定。载体构建过程中,按照试剂盒说明书完成小量质粒纯化抽提和胶回收。1.5诱导表达菌体的制备表达质粒pET-16bOR转化感受态大肠杆菌BL21(DE),挑选含表达质粒的单克隆菌37℃培养过夜,取100μL接种于10mLLB培养基中,37℃培养4～6h后(A600nm=0.4～0.6),取1mL菌液,并收集菌体作为诱导表达前的对照,其余菌液中加异丙基硫代半糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L,26℃培养12h,4℃放置24h,取1mL菌液并收集菌体。1.6facscalibur流式细胞仪检测calibur流式细胞收集诱导前和诱导后的细菌样品,PBS(0.01mol/L)洗涤2次,1mLPBS重悬细菌沉淀送FACSCalibur流式细胞仪检测,488nm激光激发下计数。同样的细菌样品滴加在载玻片,在激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP)下观察,激发波长为488、568nm,收集波长为620～670nm。1.7his融合蛋白的吸附和洗脱收集100mLIPTG诱导表达菌,将其悬浮于4mL裂解缓冲液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑pH8.0)中,经超声波破菌后,15000×g4℃离心30min,保留上清液。取Ni2+-NTAagarose填料柱(每毫升树脂可吸附6×His融合蛋白8～10mg)预先用10mL裂解缓冲液平衡,细菌裂解上清经0.45μm滤漠过滤后缓慢过柱吸附;10mL的洗涤缓冲液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑pH8.0)洗去杂蛋白;专一性吸附的6×His融合蛋白用洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,250mmol/L咪唑pH8.0)进行洗脱;洗脱峰在透析液(100mmol/LTris,pH8.5,100mmol/LNaCl)中透析过夜。1.8蛋白质sds-表面电泳蛋白样品加入2×SDS上样缓冲液,煮沸上样或直接上样,按Sambrook实验手册进行蛋白质SDS电泳,考马斯亮兰染色,由于dsRed蛋白对SDS耐受,未煮沸样品可发出荧光,在紫外光照射下观察胶中的荧光带。1.9分离的氨酸单克隆抗体按Roche公司的ECLSystemforWesternBlot试剂盒说明书进行,抗6×组氨酸单克隆抗体为一抗,用诱导前样品作为阴性对照。2结果2.1重组质粒pivde-bamh表达我们分3步构建dsRed与OVA表位融合蛋白的表达载体,首先将合成的寡聚核甘酸变性退火成双链DNA接头,连接进NotⅠ-BamHⅠ酶切的pIVEX2.4a载体。此接头含有OVA257-264[SIINFEKL]表位的编码序列和一个AgeⅠ酶切位点;随后pdsRed-C1的AgeⅠ-BamHⅠ片段进入pIVEX2.4aOVA,鉴定重组子命名为pIVEX2.4aOR;最后pIVEX2.4aOR的XhoⅠ-XbaⅠ酶切片段克隆进pET16b,重组子命名为pET16bOR。构建的质粒图见图1。pIVEX2.4aOVA与pIVEX2.4a同时被AgeI酶切,pIVEX2.4aOVA能被线性化证明接头克隆成功,AgeⅠ-BamHⅠ双酶切pIVEX2.4aOR和XhoⅠ-XbaⅠ双酶切pET16bOR可见700bp条带。重组质粒的测序结果与预期的序列完全一致(图2)。2.2细菌红色荧光检测含表达质粒的单克隆菌经异丙基硫代半糖苷(IPTG)26℃诱导培养24h,4℃放置24h后,肉眼可见细菌成明显红色,在激光共聚焦显微镜下观察,激发波长为488、568nm,收集波长为620～670nm时,可见明显红色荧光(图3),这说明大肠杆菌高效表达了dsRed与OVA表位的融合蛋白,并且此重组表达的融合蛋白仍具有dsRed蛋白荧光特性。2.3sds-东南角荧光带分析从SDS结果(图4)可以看到融合蛋白高效表达,诱导后的样品有明显的表达条带,凝胶灰度扫描显示其表达量达到菌体总蛋白的40%以上。大约50%的表达产物以包涵体形式存在,30%～40%的重组蛋白以可溶形式存在。从煮沸变性样品SDS结果可见表达条带约为Mr31000,与重组基因编码融合蛋白的理论推算值相符,可推测此条带为融合蛋白的单体,在紫外光照射下未见荧光带,而未煮沸的非变性样品的SDS在紫外光照射下可见荧光带,其对应表达条带约为Mr200000,根据文献推测,此条带可能为融合蛋白的四聚体。上述表达融合基因的重组大肠杆菌进行扩大规模的培养,获得100mL左右的细菌培养物,经超声破碎后,Ni2+-NTAagarose纯化融合蛋白,纯化融合蛋白的SDS和Westernblot分析(图5)。结果显示纯化蛋白条带单一,非变性样品在紫外光照射下可见荧光带,其对应表达条带约为Mr200000,为融合蛋白的四聚体,Westernblot分析可见,纯化融合蛋白的样品被检测到免疫杂交带。3dsrape,东北方表达融合蛋白的表达,为示踪外源蛋白在抗原递呈细胞中转运和降解,我们构建了dsRed与OVA表位融合蛋白的表达质粒,并表达和纯化了此蛋白。在构建dsRed与OVA表位融合蛋白的高效表达质粒过程中,我们发现不同的表达载体(pIVEX2.4a和pET-16b)虽然都是具有T7启动子的表达质粒,但pIVEX2.4aOR转化大肠杆菌BL21后基本不表达融合蛋白,而pET-16OR转化大肠杆菌BL21可高效的表达,这体现了不同表达质粒的元件组成差异对蛋白表达的影响。dsRed是近年发现的一个新的荧光蛋白,它可发射更强的红色荧光,但此蛋白的原核表达纯化发现,此蛋白对大肠杆菌有毒性效应。所以在诱导表达时,我们尝试使用低温26℃培养,发现此方法可诱导大量dsRed蛋白的表达。另外,由于dsRed有着较长