头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金葡菌的效果评价

头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金葡菌的效果评价

自抗生素出版以来，细菌药物的问题一直在发生。治疗耐青霉素葡萄球菌的药物甲氧西林使用仅两年,Jevens就报道了耐甲氧西林金葡菌的出现,之后耐药性日趋严重,现已成为医院感染的重要病原菌之一。因此对MRSA进行准确有效的检测及耐药性分析,对控制医院内感染的流行,指导临床用药具有重要意义。本文以特异性mecA基因PCR检测法为参考方法对头孢西丁与苯唑西林纸片扩散法检测MRSA进行比较分析,并对42株MRSA进行耐药性分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1mrsa的分离和鉴定2004年4月至2004年12月间临床感染标本分离获得95株MRSA,其中痰24株、分泌物9株、咽拭子2株、深静脉置管2株、血1株、尿1株、脓液1株、组织1株。1.1.2美国运行u3000美国(1)11种抗生素纸片(青霉素、红霉素、苯唑西林、头孢西丁、克林霉素、万古霉素、头孢呋辛、奈替米星、左氧氟沙星、氨苄西林/舒巴坦和头孢唑林)由美国BD公司生产。(2)MH琼脂购于北京奥博星生物技术公司。(3)mecA引物选自金葡菌PBP2a开放阅读框,PCR引物1:5′-AAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′,PCR引物2:5′-AGTTCTGCAGTACCGGATT-TGA-3′,引物由上海复星公司合成,并提供配套试剂(DNA提取液、TaqDNA聚合酶、dNTP等)。(4)金葡菌胶乳凝集试剂购于法国Bio-Merieux公司。1.1.3仪器PCR扩增仪PE-9700由美国PE公司生产;电泳检测系统为美国BIORAD公司产品。1.1.4质量控制标准的蘑菇金葡菌ATCC25923和金葡菌ATCC43300。1.2方法1.2.1金葡菌的鉴定常规培养分离细菌,用金葡菌胶乳凝集试剂鉴定,凝集试验阳性确定为金葡菌。1.2.2苯唑林斯基苯磺酸盐的抑菌效果将纯培养金葡菌液调至1.5×108CFU/ml,均匀涂抹于厚度为4mm的MH琼脂平板上,将含量为每片1μg的苯唑西林贴于平板上,35℃孵育24h,抑菌圈直径≤10mm为耐药,≥13mm为敏感。1.2.3头孢西丁贴/平板平板法将纯培养金葡菌液调至1.5×108CFU/ml,均匀涂抹于厚度为4mm的MH琼脂平板上,将含量为每片30μg的头孢西丁贴于平板上,35℃孵育24h,抑菌圈直径≤19mm为耐药,≥20mm为敏感。1.2.4pcr扩增总dna提取取纯培养金葡菌及标准菌株,用无菌生理盐水配成3×108CFU/ml,各取菌悬液10μl加DNA提取液50μl(严格按PCR配套试剂说明书操作),100℃水浴10min,15000r/min离心5min,取5μl上清液扩增。取扩增产物10μl于2.0%琼脂糖(内含0.5μg/L溴乙啶)TEB缓冲系统电泳,紫外透射下检测。1000bp出现条带为阳性。1.2.510种抗生素km-p按照美国临床实验室标准化研究院CLSI(原NCCLS)标准进行。2结果2.1meca基因检测结果见表1。(1)近年来,研究证明mecA基因是金葡菌耐甲氧西林的主要分子基础,检出mecA基因是目前公认的判断MRSA的主要标准。95株金葡菌中检出mecA基因阳性株42株,即MRSA42株。(2)头孢西丁纸片扩散法检测出40株MRSA,其中mecA基因阳性株39株,另1株为假阳性MRSA,漏检3株MRSA。方法特异性97.5%,灵敏度92.9%。(3)苯唑西林纸片扩散法检测出44株MRSA,其中mecA基因阳性株36株,另8株为假阳性MRSA,漏检6株MRSA。方法特异性为81.8%,灵敏度85.7%。2.24耐药药物及耐药结果见表2。MRSA对青霉素、苯唑西林100%耐药,对万古霉素全部敏感,对红霉素、头孢唑林、克林霉素、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、左氧氟沙星、奈替米星表现不同程度的耐药。MSSA对青霉素、红霉素、克林霉素耐药性分别为98.1%、71.7%、35.8%,对其他抗生素敏感性均较高。3诊断结果的比较结果(1)MRSA检测的方法学目前研究认为mecA基因是MRSA的主要耐药分子基础,检测mecA基因是判断MRSA的公认标准。但由于设备、费用等限制,不易在临床实验室常规开展。纸片扩散法快速、简便,价格便宜,易被检验人员接受。由于纸片扩散法是针对表型检测MRSA,而MRSA的表型表达通常是不均一的,因此给检测带来一定困难,容易出现误差,例如,研究结果所示苯唑西林纸片法检测出8株假阳性MRSA,漏报6株,特异性及灵敏度略超过80%;头孢西丁纸片法检出假阳性MRSA1株,漏报3株。但其特异性、敏感性较苯唑西林纸片法均有提高(P<0.05),减少了非mecA基因介导的假MRSA检出,提高了MRSA检出率,因此2004年CLSI推荐将头孢西丁代替苯唑西林检测mecA基因介导的MRSA。此举降低了假MRSA造成的医疗浪费及漏检引起的治疗失败,使临床医生对这类感染的治疗更有针对性。(2)MRSA除对甲氧西林耐药外,对其他所有与甲氧西林有相同结构的β-内酰胺类和β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂类抗生素均耐药,还可通过改变抗生素作用靶位、产生修饰酶、降低膜通透性等机制,对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类等抗生素产生不同程度耐药,惟有