定性免疫学检验的性能验证与质量控制课件

定性免疫学检验的性能验证与质量控制ISO15189实验室认可系列培训讲座1ISO15189实验室认可系列培训讲座xx定性免疫项目如：ELISA检测、自身抗体免疫印迹试验、抗核抗体免疫荧光（IIF）检测质量控制和性能验证及验证内容？如何做？标准？23ISO15189实验室认可系列培训讲座4xx5.5.1.1

检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少

应包括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临

床诊断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比

对），如为定量方法应验证精密度（包括重复性和中

间精密度）；并应明确检验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。CNAS-CL39：2012《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明-2014改版ISO15189实验室认可系列培训讲座5xxn

试剂盒说明书（先决条件！）n

国际和／或国内标准67ISO15189实验室认可系列培训讲座8xxn筛查试验

n诊断试验

n确认实验

nC50nC5nC95ISO15189实验室认可系列培训讲座9xxn筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分析物的存在情况。n一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。如粪便隐血检测ISO15189实验室认可系列培训讲座10xxn用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在。n诊断试验需具有良好的敏感性和特异性。n诊断试验后如需进行确认试验，对诊断试验的特异性要求可以稍微降低。如各种微生物培养ISO15189实验室认可系列培训讲座11xxn确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果的确认。n对于确认试验，特异性比敏感性更为重要。如梅毒密螺旋体抗体荧光吸收试验（FTA-ABS）ISO15189实验室认可系列培训讲座n一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。C5012xxISO15189实验室认可系列培训讲座13xxn这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓度，其一旦确定，是不变的。n试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号值，每次测定都会有所差异。ISO15189实验室认可系列培训讲座n一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性结果时该分析物的浓度。C514xxISO15189实验室认可系列培训讲座n一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性结果时该分析物的浓度。C9515xxISO15189实验室认可系列培训讲座16xxn应熟悉待验证的试剂或系统n进行必要的培训，包括样本的处理和储存、试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结果合理的解释以及系统的质量控制等。n制定质量保证计划n确定患者样本的数量及强弱（评价重复性）n确定比较的方法ISO15189实验室认可系列培训讲座17xxn质控品：可为商品质控品，有阳性和阴性。nC50和可能的C5（低于C50浓度20%）及C95浓度样本（高于

C50 浓度

20%

） ：用于重复性及最低检出限证，不少于40次检测量）n临床样本或血清盘（准确性验证）（不少于50份阳性和阴性样本）ISO15189实验室认可系列培训讲座18xxn进行重复性研究时，理想情况下需绘制在规定条件下候选方法的整个不精密度曲线，然而具体操作时需要检测的样本数量较大n可使用一个简单的方法，即为待评价的检测方法建立分析物的临界浓度，并判定某一特定浓度范围，例如C50±20%，是否包含了C5-C95区间。n若-20%到+20%浓度范围包含了C5-C95区间，那么20%或距离C50更远浓度的样本将得到一致的检测结果，即在

C5-C95区间之外的样本检测结果可认为是精密的，浓度>C95，将持续得到阳性结果，浓度<C5，将持续得到阴性结果。±20%仅用于举例，实验室也可根据检验目的和可接受的精密度选择±10%或±30%。ISO15189实验室认可系列培训讲座n评价定性检测试剂或系统精密度时，需采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。n定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围≤C50±20%。19xxISO15189实验室认可系列培训讲座20xxISO15189实验室认可系列培训讲座21xxISO15189实验室认可系列培训讲座22xxn检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。n如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓度即为临界点（C50）。CLSI

EP12-A2

User

Protocol

for

Evaluation

of

QualitativeTestPerformance;

Approved

GuidelineISO15189实验室认可系列培训讲座23xx40次测试C501阳性结果=<13/40(32.5%)不正确>=27/40(67.5%)2阳性结果（14-26）/40（35%-65%）正确ISO15189实验室认可系列培训讲座24xxISO15189实验室认可系列培训讲座25xxISO15189实验室认可系列培训讲座26xxISO15189实验室认可系列培训讲座27xxn制备评价用样本制备3份样本。一份浓度为C50，一份为C50+20%，一份为C50-20%。每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的需要。n评价方法每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。ISO15189实验室认可系列培训讲座-20%～+20%浓度范围在C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样本检测结果不一致；此结论错误率5%，需使用更宽浓度范围的样本（如±30%）进行另外的试验。28xxISO15189实验室认可系列培训讲座-20%～+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样本检测结果一致29xxISO15189实验室认可系列培训讲座用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。30xxISO15189实验室认可系列培训讲座用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%）进行补充试验。31xxISO15189实验室认可系列培训讲座32xxn检测限（

limit

of

detection

）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lowerdetectablelimit

of

detection ）或最小检出浓度（

minimumconcentration

），

有时也称为分析灵敏度（analytical

sensitivity）。n如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于

C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以测出的最低被测量浓度。ISO15189实验室认可系列培训讲座33xxn评估试剂分析敏感性所使用的样本，如检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本，是更有意义的。n处于测定下限浓度（如C95）的样本，重复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。34ISO15189实验室认可系列培训讲座35xx概

述特定的定性免疫测定系统或试剂的准确度以与临床诊断、金标准方法和经过验证确认血清样本盘的检测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符合率来表示。ISO15189实验室认可系列培训讲座36xxn临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现阳性结果和确定患者患病）；注：该临床疾病必须由不依赖于被评价试验的标准确定。n临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。ISO15189实验室认可系列培训讲座37xx研究人群有一些研究的人群，仅包括健康人群和疾病严重的人群，而忽略了介于两种状态之间的人群和一些不典型的患病人群。将这部分人群剔除在研究人群之外，会优化评价的结果，造成试剂在实际应用当中结果简单明确的假象。因此，研究人群最好符合以下要求：——涵盖疾病的各个阶段；——涵盖一些不典型的、较难诊断的患病人群；——各组不同特征的人群均需有一定的数量。总之，研究的人群要能够代表该检测系统或试剂预期使用的人群，否则给出的数据将存在偏倚。ISO15189实验室认可系列培训讲座试剂的检测结果共计分析物阳性分析物阴性阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数FNTNFN+TN共计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性×100%特异性×100%阳性预测值×100%阴性预测值×100%符合率×100%注1:式中：TP—分析物存在时检测结果为阳性的数量。

FP—分析物不存在时结果为阳性的数量。

TN—分析物不存在时检测结果为阴性的数量。

FN—分析物存在时检测结果为阴性的数量。39xxISO15189实验室认可系列培训讲座40xxn作为筛查试验，检测的敏感性应>95%。作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应>95%。作为确认试验特异性应>98%-99%。ISO15189实验室认可系列培训讲座以上公式中，1.96是从标准正态分布对应的95％可信区间得来的。若置信水平改变，则1.96也应被相应的百分位点所替代。41xxISO15189实验室认可系列培训讲座表： 待评价试剂与诊断标准相比较进行敏感性、特异性的计算举例42xx待评价试剂的检测结果诊断标准分析物存在分析物不存在总计阳性结果数88290阴性结果数14336350共计102338440n敏感性=100%×88/102=86.3%

n特异性=100%×336/338

=99.4%n敏感性和特异性的95%置信区间为敏感性(74.3%,93.2%)和特异性(96.7%,99.9%)。ISO15189实验室认可系列培训讲座43xx概

述n如果没有可用的诊断标准，那么厂家需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。n这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试剂和已验证方法的一致性程度。ISO15189实验室认可系列培训讲座44xx表：待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂的检测结果已验证方法+

-+ab-cd共计a+cb+d阳性符合率=a/(a+c)

×100%。阴性符合率=d/(b+d)

×100%。总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%。n需要特别说明的是，阳性符合率可以解释为已验证方法检测结果为阳性的样本中待评价试剂的阳性率，ISO15189实验室认可系列培训讲座45xx表：待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算举例待评价试剂的检测结果已验证方法总计+-+801090-8342350共计88352440阳性符合率=80/88

×100%=90.9%。阴性符合率=342/352

×100%=97.2%总符合率=(80+342)/440

×100%=95.9%95%置信区间为：敏感性(78.8%,96.4%)和特异性(93.5%,98.8%)。ISO15189实验室认可系列培训讲座46xxn每次实验，应立即记录所有原始检测数据并复核，以早期发现分析系统及人为误差的来源。n一旦发现某些结果是由可解释的误差引起的，则应将其记录下来，同时，这些结果不能用于数据分析。

n如不能确定误差产生的原因，则保留原始结果。ISO15189实验室认可系列培训讲座47xxn第三方质控品n检测系统配套质控品

n自制质控品质控品的来源ISO15189实验室认可系列培训讲座48xxn基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起非特异或中和反应造成假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性的小牛血清等。n稳定性：室内质控需要观察一段时间，一般选择生产者声明在一定保存条件下如2-8℃或-20℃以下有效期为6个月以上。要特别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通常前二者的有效期要短许多。实验室应对这些有效期进行验证。质控物的选择ISO15189实验室认可系列培训讲座49xxn质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不能固定而应随机放置。n试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT

OFF值或阈值的，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。ISO15189实验室认可系列培训讲座50xxn高值或超高值阳性血清是用来监控“HOOK效应”的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于CUT

OFF 值对边缘结果的监控也无任何价值。ISO15189实验室认可系列培训讲座51xxo质控品水平：n

阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为ELISA或CLIA质控品浓度宜0.5倍临界值左右）n

阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物o

ANA

1:1000anti-dsDNA 1:100或以上anti-ENA

中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性ISO15189实验室认可系列培训讲座52xxo

质控品水平：n

弱阳性质控品：ELISA、CLIA：临界值2~4倍的样本IIF:比临界值高1个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。nANA

：1：100～1:320，ANA模型：斑点型，或均质型，或核仁型，或胞浆型等（可以每6个月变换，存储质控品至少有2个模型！）n

anti-dsDNA：1:10～1:32nanti-ENA：低度阳性或临界值2~4倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）ISO15189实验室认可系列培训讲座53xx大量的临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自制，其步骤为：收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清)到一定量（至少够本室使用6个月以上的量）；传染性病原体需经56℃、10小时灭活后使用；0.2μm生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；稀释，用正常人血清稀释；IIF方法ANA弱阳性质控品（均质型），将混合血清浓度调整到其临界值（1:100）或高1个滴度（1:320）或之间；测定值，与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2-4倍Cut

Off值附近的阳性值；分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20℃冻存备用；稳定性及瓶间差评价。ISO15189实验室认可系列培训讲座54xxn

不同保存条件下以数值计算方法：抽样方法同均一性•2℃-8℃：CV值、累计CV值，稳定期•-80℃：CV值、累计CV值，稳定期室温：CV值、累计CV值，稳定期以定性判定方法：抽样方法同均一性•2℃-8℃：滴度的符合率，累计符合率，稳定期•-80℃：滴度的符合率，累计符合率，稳定期室温：滴度的符合率，累计符合率，稳定期均一性评估：同批号质控品随机抽取5支（瓶），≥80%符合为合格。稳定性评估：评估1周，1月，3月，6月，1年。有效期一般可标定为1年。ISO15189实验室认可系列培训讲座55xxo纯定性试验：如免疫印迹、斑点渗滤等，除膜条本身的内对照外：n

每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。n

质控判定规则阴性质控品的检测结果为阴性弱阳性质控品的检测结果为弱阳性如：抗ENA抗体谱检测ISO15189实验室认可系列培训讲座56xxo以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验等，n

每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。n

质控判定规则：阴性质控结果为阴性弱阳性质控结果在靶值上下一个滴度或稀释度如：ANA、anti-dsDNA、ANCA、AMA、SMA等ISO15189实验室认可系列培训讲座57xxo

用数值判定结果的试验：如ELISA、CLIA等。n

浓度：弱阳性质控品浓度宜在2～4倍临界值左右，阴性质控品浓度宜0.5倍临界值左右（两个水平）。n

频次：若是ELISA应每板做质控，若是CLIA每分析批做质控。n

质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个系统误差规则。12s警告，13s和22s失控。如：anti-PR3、ACL、anti-CCP等ISO15189实验室认可系列培训讲座58xxn发现问题n分析问题产生的原因n采取纠正措施加以改进，进而预防

n验证和追踪避免同样的问题出现第二次！ISO15189实验室认可系列培训讲座59xxn阳性质控品失控的常见原因:稳定、偶然误差。污染、温育时间不n阴性质控品的常见失控原因：污染、洗板不干净、标本间的交叉污染。n处理措施：全自动加样系统‚一次性吸头的使用，洗板机的维护，洗液的定期更换，温育温度和温

育时间的保证，加样器的准确，荧光显微镜的维

护。ISO15189实验室认可系列培训讲座60xxISO15189实验室认可系列培训讲座61xx检定或校准：至少每年1次n加样器的校准可依据ISO/DIS8655文件和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测试方法。这是目前用于此类仪器有效的校准方法。ISO15189实验室认可系列培训讲座62xxn

测定波长：400-750nmn

吸光度范围：0.0-4.0，线性误差<2.0%，精密度CV<0.2%n光学系统：垂直光路多通道（硅胶管或光导纤维）n

检测速度：数秒n

震板功能

n

温育功能

n

软件功能ISO15189实验室认可系列培训讲座n

酶标仪校准至少1年1次，可由计量部门或厂家完成，实验室验证核心：比色测定的

准确性线性精密性63xxISO15189实验室认可系列培训讲座稳定激发光优质光路光强校验64xxISO15189实验室认可系列培训讲座65xxn

校准：至少每年1次，可有厂家完成，实验室验证n

汞灯：寿命一般200小时，及时更换n

正确使用：尤其开机、关机（两次开启光源间隔要在20分钟以上）ISO15189实验室认可系列培训讲座66xxn5.6.3.1应按照CNAS-RL02《能力验证规则》的要