环境生物化学

蛋白质存在于一切的生物细胞中，是构成生物体最根本的构造物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质根底，它参与了几乎一切的生命活动过程。第一章蛋白质(Protein)第一节概述一、蛋白质的定义蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸经过肽键衔接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子构造和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在<反杜林论>中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。〞可以看出，第一，蛋白体是生命的物质根底；第二，生命是物质运动的特殊方式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实际完全证明并开展了恩格斯的结论

1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分蛋白质占干重人体中〔中年人〕人体45%水55%细菌50%~80%蛋白质19%真菌14%~52%脂肪19%酵母菌14%~50%糖类＜1%白地菌50%无机盐7%2.蛋白质是一种生物功能的主要表达者〔1〕酶的催化作用〔2〕调理作用(多肽类激素)〔3〕运输功能〔4〕运动功能〔5〕免疫维护作用(干扰素)〔6〕接受、传送信息的受体〔7〕毒蛋白3.外源蛋白质有营养功能，可作为消费加工的对象.三、蛋白质的组成1.元素组成

蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50％氢7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量

氮占生物组织中一切含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大约含量

★蛋白质含量的测定：凯氏定氮法

(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺陷：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不准确。普通，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就阐明含有6.25g蛋白质〕；故：※蛋白质含量=氮的量×100/16×6.25

除了上法外，还有紫外比色法

双缩脲法

Folin—酚

考马斯亮兰G—250比色法〔条件：蛋白质必需是可溶的〕2.化学组成〔两种类型〕单纯蛋白质：水解为α-氨基酸结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基

第二节氨基酸化学一、氨基酸的构造与分类(2).除甘氨酸外,其它一切氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。1.氨基酸的构造氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的根本单位。从蛋白质水解物中分别出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在构造上的共同特点为：(1).与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因此称为α-氨基酸COOHH2NCHα-碳原子基团RR基团α-氨基酸根本构造通式

2.常见氨基酸的分类中性AA〔1〕按R基团的酸碱性分酸性AA碱性AA〔2〕按R基团的疏水性R基团AA电性质分不带电荷极性R基团的AA带电荷R基团的AA脂肪族A〔3〕按R基团的化学构造分芳香族AA杂环族AA

3.构成蛋白质的20种氨基酸

4.人体所需的八种必需氨基酸赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)酪氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)５.几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分别出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的根本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的构造如下

二.氨基酸的重要理化性质1.普通物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其外形因构型而异溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，普通在200℃以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用〔-〕表示，右旋者用〔+〕表示。(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只需酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的才干。

酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;

2.氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形状或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基方式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)方式存在，羧基是以离解形状(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的形状也随之发生变化PH1710净电荷+10-1正离子两性离子负离子等电点PI

3.氨基酸的等电点当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极挪动，即氨基酸处于两性离子形状。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决议于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-)/2硷性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/24.氨基酸的化学性质(1)与茚三酮的反响〔颜色反响〕

氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反响，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为复原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，本身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为复原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及复原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。★★★反响要点A.该反响由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反响非常灵敏，可在570nm测定吸光值D.测定范围：0.5~50µg/mlE.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质〔不释放NH3〕运用：A.氨基酸定量分析〔先用层析法分别〕B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分别，自动定性定量，记录结果。(2)与甲醛反响

反响特点A.为α-NH2的反响B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反响，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。运用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法〔间接滴定〕A.直接滴定，终点pH过高〔12〕，没有适当指示剂。B.与甲醛反响，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基〔摩尔比1：1〕D.简单快速，普通用于测定蛋白质的水解速度。(3)与2,4-二硝基氟苯〔DNFB〕反响

反响特点A.为α-NH2的反响B.氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸运用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的ε-NH2、酚羟基也能与DNFB反响，但其生成物，容易与α-DNP氨基酸区分和分别

★首先由Sanger运用，确定了胰岛素的一级构造A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分别DNP-氨基酸D.由Edman于1950年首先提出为α-NH2的反响用于N末端分析，又称Edman降解法肽分子与DNFB反响，得DNP-肽层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目(4)与异硫氰酸苯酯〔PITC〕的反响

Edman〔苯异硫氰酸酯法〕氨基酸顺序分析法实践上也是一种N-端分析法。此法的特点是可以不断反复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进展标志和解离。

肽链〔N端氨基酸〕与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最接近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分别PTH-氨基酸层析法鉴定Edman降解法的改良方法---DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法一样但水解后的DNS-氨基酸不需分别，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有剧烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量

用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链灵敏度提高，能延续测定。多肽顺序自动分析仪样品最低用量可在5pmol〔5〕与荧光胺的反响α-NH2的反响氨基酸定量〔6〕与5,5’-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反响-SH的反响测定细胞游离-SH的含量〔7〕其他反响成盐、成酯、成肽、脱羧反响第三节蛋白质的分子构造蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严厉的界限，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大一.根本问题---肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水构成的酰胺键称为肽键，所构成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽那么称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。

1.多肽

在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序陈列，这种陈列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开场，以C-端氨基酸残基为终点的陈列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

2.肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自在旋转。在大多数情况下，以反式构造存在。

3.天然存在的重要多肽

在生物体中，多肽最重要的存在方式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离形状存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽Leu-脑啡肽

二.蛋白质的一级构造1.蛋白质的一级构造(Primarystructure)包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目.(2)多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的根底。2.蛋白质的一级构造的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研讨的根底。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级构造以来，如今曾经有上千种不同蛋白质的一级构造被测定。(1)测定蛋白质的一级构造的要求

A.样品必需纯〔>97%以上〕；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。(2)测定步骤①多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必需先进展拆分。几条多肽链借助非共价键衔接在一同，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处置，即可分开多肽链(亚基).

②测定蛋白质分子中多肽链的数目：经过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。③二硫键的断裂：几条多肽链经过二硫键交联在一同。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处置，使二硫键复原为巯基，然后用烷基化试剂维护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以经过参与盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；运用过甲酸氧化法或巯基复原法拆分多肽链间的二硫键。

★巯基的维护④测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽链的N-末端和C-末端★末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：

二硝基氟苯〔DNFB〕法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯〔二甲氨基萘磺酰氯〕可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以到达110-9mol。肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其他的氨基酸那么变成肼化物。肼化物可以与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分别。

氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反响时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反响时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反响时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的一切C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。⑥多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其别分开来。多肽的选择性降解的方法有：酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所构成的肽键。⑦测定每个肽段的氨基酸顺序。⑧确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。⑨确定原多肽链重二硫键的位置：普通采用胃蛋白酶处置没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分别出各个肽段，用过甲酸处置后，将每个肽段进展组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进展比较，确定二硫键的位置。三.蛋白质的空间构造1.蛋白质的二级构造蛋白质的二级(Secondary)构造是指肽链的主链在空间的陈列,或规那么的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间构成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。(1).-螺旋在-螺旋中肽平面的键长和键角一定,肽键的原子陈列呈反式构型,相邻的肽平面构成两面角.①多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，构成螺旋构造，螺旋一周，沿轴上升的间隔即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的间隔0.15nm.②肽链内构成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基构成氢键。③蛋白质分子为右手-螺旋。左手和右手螺旋

〔2〕-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行陈列，经过链间的氢键交联而构成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。①在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.②-折叠构造的氢键主要是由两条肽链之间构成的；也可以在同一肽链的不同部分之间构成。几乎一切肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。③-折叠有两种类型。一种为平行式，即一切肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。〔3〕-转角在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个构成转角的残基中，第三个普通均为甘氨酸残基．弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间构成氢键，构成一个不很稳定的环状构造。这类构造主要存在于球状蛋白分子中。〔４〕自在回转没有一定规律的松散肽链构造，但仍是严密有序的稳定构造，经过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不同的蛋白质，自在回转的数量和方式各不一样．分两类：①严密环②衔接条带２．超二级构造和构造域〔１〕超二级构造在蛋白质分子中，由假设干相邻的二级构造单元组合在一同，彼此相互作用，构成有规那么的、在空间上能识别的二级构造组合体。几种类型的超二级构造：αα；ββ；βαβ；βββ．★超二级构造在构造层次上高于二级构造，但没有聚集成具有功能的构造域．ααβββαβ〔２〕构造域对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级构造。这种相对独立的三维实体就称构造域。构造域通常是几个超二级构造的组合，对于较小的蛋白质分子，构造域与三级构造等同，即这些蛋白为单构造域。构造域普通由100~200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400个残基。氨基酸可以是延续的，也可以是不延续的．构造域之间常构成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个构造域的界面上．构造域之间由“铰链区〞相连，使分子构象有一定的柔性，经过构造域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，构造域可作为构造单位进展相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的构造，甚至保管某些生物活性．★构造域与功能域的关系：有时一个构造域就是蛋白质的功能域，但不总是．包含一个但通常是多个构造域３．蛋白质的三级构造蛋白质的三级构造是指多肽链在二级构造的根底上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间构造。包括主链和侧链的一切原子的空间排布．普通非极性侧链埋在分子内部，构成疏水核，极性侧链在分子外表．４．蛋白质的四级构造许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级构造经过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级构造单元称为亚基。蛋白质的四级构造是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级构造得测定由佩鲁茨1958年完成，其构造要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条α链，两条β链，α2β2α链：141个残基；β链：146个残基分子量65000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子外表，疏水性基团在分子内部三．蛋白质分子中的共价键与次级键一级构造→二级构造→超二级构造→构造域→三级构造→亚基→四级构造维系蛋白质分子的一级构造：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级构造：氢键维系蛋白质分子的三级构造：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级构造：范德华力、盐键a盐键〔离子键〕b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级构造特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力第四节蛋白质分子构造与功能的关系一.蛋白质一级构造与功能的关系研讨蛋白质一级构造与功能的关系主要是：研讨多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进展这方面的研讨常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序类似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。例1镰刀形贫血病患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白〔Hb-S〕它与正常的血红蛋白〔Hb-A〕的差别：仅仅在于β链的N-末端第6位残基发生了变化〔Hb-A〕第6位残基是极性谷氨酸残基，〔Hb-S〕中换成了非极性的缬氨酸残基使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧才干下降，易发生溶血这阐明了蛋白质分子构造与功能关系的高度一致性例2一级构造的部分断裂与蛋白质的激活体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性形状，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只需当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级构造中有许多位置的氨基酸对一切种属来说都是一样的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判别生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发扬特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基能够随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差别数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差别少，反之那么多〔进化树〕.黄色：不变残基〔invariableresidues〕蓝色：保守氨基酸〔conservativeresidues〕未标志：可变残基〔variableresidues〕二.蛋白质的构象与功能的关系别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改动蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改动的景象.它是细胞内最简单的调理方式.例：血红蛋白的别构效应一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改动进而引起另三个亚基的构象改动整个分子构象改动与氧的结合才干添加第五节蛋白质的性质一.蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10000.最高可达40000000〔烟草花叶病毒〕．蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成分只需一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量＝〔知成分的相对分子、原子质量〕/知成分的百分含量假设蛋白质分子中所含知成分不是一个单位，那么真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2.超离心法在60000～80000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向挪动用光学方法测定界面挪动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和外形有关沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1～200S由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D〔1－iρ〕R：气体常数T：绝对温度D：分散系数ρ：溶剂的密度3.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状构造一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子那么被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状构造中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量普通用葡聚糖，商品名：Sephadex测得几种规范蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数〔logM〕对Ve作图，得规范曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从规范曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比〔净电荷、大小、外形〕用SDS和巯基乙醇〔翻开二硫键〕处置蛋白量变性〔肽链伸展〕并与SDS结合，构成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电〔SDS带负电〕；且荷质比一样〔蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少〕不同蛋白质分子具有类似的构象用几种规范蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从规范曲线上查出样品的相对分子质量

★影响迁移率的主要要素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力〔主要要素〕凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小★优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺陷：误差大，约为±10％〔误差主要来源于迁移间隔的丈量误差〕★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量二.蛋白质的两性离解和电泳景象蛋白质与多肽一样，可以发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不挪动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极挪动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极挪动。这种景象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳景象。利用蛋白质的电泳景象，可以将蛋白质进展分别纯化。三.蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中可以构成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔景象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能经过半透膜，因此可以运用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。四.蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改动溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质可以从溶液中沉淀出来。

1.可逆沉淀(1)在温暖条件下，经过改动溶液的pH或电荷情况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分别。(2)在沉淀过程中，构造和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解构成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分别和纯化蛋白质的根本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在剧烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的构造和性质，产生的蛋白质沉淀不能够再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的构造和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。五.蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的构造亲密相关。某些物理或化学要素，可以破坏蛋白质的构造形状，引起蛋白质理化性质改动并导致其生理活性丧失。这种景象称为蛋白质的变性.变性蛋白质通常都是固体形状物质，不溶于水和其它溶剂，也不能够恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要要素是热、紫外光、猛烈的搅拌以及强酸和强碱等。六.蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进展定性鉴定。七.蛋白质的颜色反响1.双缩脲反响：

两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反响肽键的反响，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度

2.米伦氏反响酪氨酸的显色反响〔酚羟基反响〕米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，参与米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反响在蛋白质溶液中参与HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢参与，不使相混，在液面交界处，即有紫色环构成色氨酸的反响〔吲哚环的反响〕鉴定蛋白质中能否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反响精氨酸的反响〔胍基的反响〕精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠〔或次溴酸钠〕溶液中发生反响，产生红色产物鉴定蛋白质中能否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反响酪氨酸、色氨酸的反响〔复原反响〕福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合---Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反响蛋白质-铜络合物，将福林试剂复原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反响灵敏度差7.黄蛋白反响浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反响生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反响呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1---1000微克/毫升第六节蛋白质的分类一.根据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质：〔globularprotein〕外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能构成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrousprotein)分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。二.根据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为1.简单蛋白(simpleprotein)：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。〔1〕清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。〔2〕谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。〔3〕精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。〔4〕硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。2.结合蛋白(conjugatedprotein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成〔1〕色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。〔2〕糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。〔3〕脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。〔4〕核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。〔5〕色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。〔6〕磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。本章小节蛋白质的生物学作用：功能蛋白、构造蛋白蛋白质的组成〔元素组成、化学组成〕及蛋白质含量的测定二十种氨基酸的构造、分类及称号〔三字缩写符、单字缩写符〕氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯〔DNFB〕反响、与异硫氰酸苯酯〔PITC〕的反响蛋白质的一级构造：肽、肽键、活性多肽及一级构造的测定蛋白质的空间构造：二级构造单元〔-螺旋、-折叠、-转角、自在回转〕、三级与四级构造〔超二级构造、构造域、亚基〕及构造与功能的关系蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定〔离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法〕、两性解离〔等电点、电泳、离子交换〕、胶体性质、蛋白质沉淀〔可逆沉淀、不可逆沉淀〕、蛋白量变性、紫外吸收及颜色反响蛋白质的分类：按外形及组成分类第二章

酶(Enzyme)1.酶的概念酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专注性的特殊蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂。一、酶的概念2.酶催化作用的特点(1)酶和普通催化剂的共性：加快反响速度；不改动平衡常数；本身不参与反响。(2)酶催化作用特性：条件温暖：常温、常压、pH=7；高效率：反响速度与不加催化剂相比可提高108～1020，与加普通催化剂相比可提高107～1013；专注性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专注性是由酶蛋白的立体构造所决议的。可分为：绝对专注性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反响，而不作用于任何其它物质。相对专注性：这类酶对构造相近的一类底物都有作用。包括键专注性和簇〔基团〕专注性。立体异构专注性：这类酶不能区分底物不同的立体异构体，只对其中的某一种构型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异构专注性和几何异构专注性。易变敏感性：易受各种要素的影响，在活细胞内遭到精细严厉的调理控制。二、酶的化学本质及构造功能特点1.开展史(1)酶是蛋白质:1926年,JamesSummer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。(2)核酶的发现：1981～1982年，ThomasR.Cech实验发现有催化活性的天然RNA—Ribozyme。L19RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。1955年，发现DNA的催化活性。(3)抗体酶〔abzyme〕：1986年，RichardLerrur和PeterSchaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体〔catalyticantibody〕。酶单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。双成份酶酶蛋白辅因子〔简单蛋白质〕〔结合蛋白质〕〔apoenzyme〕〔cofacter)辅酶〔coenzyme)辅基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme〕=酶蛋白+辅因子2.酶的组成3.酶的辅因子酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反响并促进整个催化过程。(1)传送电子体：如卟啉铁、铁硫簇；(2)传送氢〔递氢体〕：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)传送酰基体：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)传送一碳基团：如四氢叶酸；(5)传送磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：转氨基，如VB6；传送CO2，如生物素。维生素和辅酶维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类小分子有机物质。多数维生素维生素作为辅酶和辅基的组成成分，参与体内的物质代谢。维生素普通习惯分为脂溶性和水溶性两大类。其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调理作用，而水溶性维生素是经过转变成辅酶对代谢起调理作用。某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一同并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶〔或辅基〕。辅酶是一类具有特殊化学构造和功能的化合物。参与的酶促反响主要为氧化-复原反响或基团转移反响。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用亲密相关。脂溶性维生素维生素A,D,E,K均溶于脂类溶剂，不溶于水，在食物中通常与脂肪一同存在，吸收它们，需求脂肪和胆汁酸。维生素A维生素A分A1,A2两种，是不饱和一元醇类。维生素A1又称为视黄醇，A2称为脱氢视黄醇。主要功能：维持上皮组织安康及正常视觉，促进年幼动物的正常生长。维生素D维生素D是固醇类化合物，主要有D2,D3,D4,D5。其中D2,D3活性最高。维生素D的构造在生物体内，D2和D3本身不具有生物活性。它们在肝脏和肾脏中进展羟化后，构成1，25-二羟基维生素D。其中1，25-二羟基维生素D3是生物活性最强的。主要功能：调理钙、磷代谢，维持血液中钙、磷浓度正常，促使骨骼正常发育。维生素E维生素E又叫做生育酚，目前发现的有6种，其中，，，四种有生理活性。主要功能：具有抗氧化剂的功能，可作为食品添加剂运用，还可维护细胞膜的完好性；同时还有抗不育的作用。维生素K维生素K有3种：K1,K2,K3。其中K3是人工合成的。维生素K是2-甲基萘醌的衍生物。主要功能：促进肝脏合成凝血酶原，促进血液的凝固。水溶性维生素维生素B1和羧化辅酶维生素B1又称硫胺素，在体内以焦磷酸硫胺素(TPP)方式存在。缺乏时表现出多发性神经炎、皮肤麻木、心力衰竭、四肢无力、下肢水肿。焦磷酸硫胺素(TPP)是脱羧酶的辅酶，催化丙酮酸或α–酮戊二酸的氧化脱羧反响，所以又称为羧化辅酶。维生素B2和黄素辅酶维生素B2又称核黄素，由核糖醇和6，7-二甲基异咯嗪两部分组成。缺乏时组织呼吸减弱，代谢强度降低。主要病症为口腔发炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。FAD(黄素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)的衍生物。它们在脱氢酶催化的氧化-复原反响中，起着电子和质子的传送体作用。泛酸和辅酶A〔CoA〕维生素B3又称泛酸，是由,-二羟基---二甲基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成。辅酶A是生物体内代谢反响中乙酰化酶的辅酶，它是含泛酸的复合核苷酸。它的重要生理功能是传送酰基，是构成代谢中间产物的重要辅酶。维生素PP和辅酶I、辅酶II维生素PP包括尼克酸〔又称烟酸〕和尼克酰胺〔又称烟酰胺〕两种物质。在体内主要以尼克酰胺方式存在，尼克酸是尼克酰胺的前体。尼克酸尼克酰胺维生素PP能维持神经组织的安康。缺乏时表现出神运营养妨碍，出现皮炎。NAD+(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I)和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II)是维生素烟酰胺的衍生物，它们是多种重要脱氢酶的辅酶。维生素B6和磷酸吡哆醛维生素B6包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6在体内经磷酸化作用转化为相应的磷酸脂，参与代谢的主要的是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。磷酸吡哆醛是氨基酸转氨作用、脱羧作用和消旋作用的辅酶。生物素生物素是B族维生素B7，它是多种羧化酶的辅酶。生物素的功能是作为CO2的递体，在生物合成中起传送和固定CO2的作用。叶酸和叶酸辅酶维生素B11又称叶酸，作为辅酶的是叶酸加氢的复原产物四氢叶酸。四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3,-CH2-,-CHO等的载体，参与多种生物合成过程。维生素B12和B12辅酶维生素B12又称为钴胺素。维生素B12分子中与Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷所取代，构成维生素B12辅酶。维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶，催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反响。维生素C维生素C能防治坏血病，故又称抗坏血酸。在体内参与氧化复原反响，羟化反响。人体不能合成。硫辛酸硫辛酸是少数不属于维生素的辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种方式：即硫辛酸〔氧化型〕和二氢硫辛酸〔复原型〕。辅酶Q〔CoQ〕辅酶Q又称为泛醌，广泛存在与动物和细菌的线粒体中。辅酶Q的活性部分是它的醌环构造，主要功能是作为线粒体呼吸链氧化-复原酶的辅酶，在酶与底物分子之间传送电子。4.酶构造与功能特点蛋白质的构造特点：一级、二级、三级、四级构造根据构造不同酶可分为：单体酶：只需单一的三级构造蛋白质构成。寡聚酶：由多个〔两个以上〕具有三级构造的亚基聚合而成。多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。与催化作用相关的构造特点(1)活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反响的空间局限〔部位〕。

结合部位(Bindingsite)：酶分子中与底物结合的部位或区域普通称为结合部位。催化部位(Catalyticsite):酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决议酶的专注性，催化部位决议酶所催化反响的性质。

调控部位(Regulatorysite):酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制造用(2)必需基团：酶表现催化活性不可短少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。亲核性基团酸碱性基团(3)酶原和酶原的激活：酶原：没有活性的酶的前体。酶原的激活：酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶。酶原转变成酶的过程称为酶原的激活。本质：酶原的激活本质上是酶活性部位构成或暴露的过程。(4)同功酶：能催化同一化学反响的一类酶。活性中心类似或一样：催化同一化学反响。分子构造不同：理化性质和免疫学性质不同。三、酶的分类及命名1.酶的分类氧化-复原酶Oxidoreductase氧化-复原酶催化氧化-复原反响。主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反响。(2)转移酶Transferase转移酶催化基团转移反响，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反响。水解酶Hydrolase水解酶催化底物的加水分解反响。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反响(4)裂解酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子构成双键的反响及其逆反响。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反响。(5)异构酶Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反响。(6)合成酶LigaseorSynthetase合成酶，又称为衔接酶，可以催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的构成反响。这类反响必需与ATP分解反响相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反响丙酮酸+CO2草酰乙酸核酸酶〔催化核酸〕Ribozyme核酸酶是独一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，可以催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反响。2.酶的命名(1)习惯命名法:根据其催化底物来命名；根据所催化反响的性质来命名；结合上述两个原那么来命名；有时在这些命名根底上加上酶的来源或其它特点。(2)国际系统命名法系统称号包括底物称号、构型、反响性质，最后加一个酶字。例如：习惯称号:谷丙转氨酶系统称号:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反响:谷氨酸+丙酮酸-酮戊二酸+丙氨酸1.酶催化作用的本质：降低反响活化能2.酶催化作用的中间产〔络合〕物学说在酶催化的反响中，第一步是酶与底物构成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+S====E-SP+E许多实验现实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物构成的速率与酶和底物的性质有关。四、酶作用的机制3.酶与底物结合构成中间络合物的方式〔实际〕(1)锁钥假说(lockandkeyhypothesis)：以为整个酶分子的天然构象是具有刚性构造的，酶外表具有特定的外形。酶与底物的结合好像一把钥匙对一把锁一样(2)诱导契合假说〔induced–fithypothesis):该学说以为酶外表并没有一种与底物互补的固定外形，而只是由于底物的诱导才构成了互补外形.4.使酶具有高效催化的要素(1)临近定向效应：在酶促反响中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大添加，有利于提高反响速度；另一方面，由于活性中心的立体构造和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反响的基团相互接近，并被严厉定向定位，使酶促反响具有高效率和专注性特点。(2)“张力〞和“形变〞：底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力〞甚至“形变〞，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。(3)酸碱催化：酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反响普通都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指经过质子酸提供部分质子,或是经过质子碱接受部分质子的作用，到达降低反响活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进展酸碱催化。His残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。广义酸基团广义碱基团〔质子供体〕〔质子受体〕(4)共价催化：催化剂经过与底物构成反响活性很高的共价过渡产物，使反响活化能降低，从而提高反响速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。1.底物浓度对酶促反响速度影响在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研讨底物浓度和反响速度的关系。如右图所示：在低底物浓度时,反响速度与底物浓度成正比，表现为一级反响特征。当底物浓度到达一定值，几乎一切的酶都与底物结合后，反响速度到达最大值〔Vmax〕，此时再添加底物浓度，反响速度不再添加，表现为零级反响。五、酶促反响的速度及其影响要素米氏方程1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进展研讨，推导出了表示整个反响中底物浓度和反响速度关系的著名公式，称为米氏方程。Km—米氏常数Vmax—最大反响速度根据中间产物学说，酶促反响分两步进展:米氏方程的推导：米氏常数Km的意义:由米氏方程可知，当反响速度等于最大反响速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常数是反响速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。1Km11=+VVmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数方式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定：2.抑制剂对酶反响的影响有些物质能与酶分子上某些必需基团结合〔作用),使酶的活性中心的化学性质发生改动，导致酶活力下降或丧失，这种景象称为酶的抑制造用。可以引起酶的抑制造用的化合物那么称为抑制剂〔inhibitor)。酶的抑制剂普通具备两个方面的特点：a.在化学构造上与被抑制的底物分子或底物的过渡形状类似。b.可以与酶的活性中心以非共价或共价的方式构成比较稳定的复合体或结合物。抑制造用的类型：(1)不可逆抑制造用：抑制剂与酶反响中心的活性基团以共价方式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。(2)可逆抑制造用：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以经过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：竞争性抑制：某些抑制剂的化学构造与底物类似，因此能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反响中心之外，其结果是酶促反响被抑制了。竟争性抑制通常可以经过增大底物浓度，即提高底物的竞争才干来消除。竞争性抑制可用下式表示：有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值随[I]的增高而增大；在[E]固定时，当[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)项可忽略不计，那么v=Vmax，即最大反响速度不变。竞争性抑制造用的速度方程：竞争性抑制造用的Lineweaver–Burk图：非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子〔Cu2+、Ag+、Hg2+〕以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改动酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竟争性抑制不能经过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制可用下式表示：有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；Km值不变。非竞争性抑制造用的速度方程：非竞争性抑制造用的Lineweaver–Burk图：有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。反竞争性抑制：酶只需在与底物结合后，才干与抑制剂结合，引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制造用的速度方程：反竞争性抑制造用的Lineweaver–Burk图：3.激活剂对酶反响的影响凡是能提高酶活力的简单化合物都称为激活剂〔activator)。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，能够是酶活性部位的组成部分，也能够作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；普通情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶那么起抑制造用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。4.酶浓度对酶反响的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反响系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发扬作用的要素时，酶促反响的速度和酶浓度成正比。5.温度对酶反响的影响一方面是温度升高,酶促反响速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级构造将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反响速度最大。最适温度6.pH对酶反响的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。7.酶的别构〔变构〕效应：由于效应物的存在，而引起酶的构造〔构象〕变化。别构酶(Allostericenzyme)的特点：普通是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调理〔别构〕部位；具有别构效应。指酶和一个配体〔底物，调理物〕结合后可以影响酶和另一个配体〔底物〕的结合才干。一样〔均为底物〕：同促效应〔homotropiceffect〕不同〔效应调理物〕：异促效应〔heterotropiceffect〕根据配体结合后对后继配体的影响根据配体性质正协同效应〔positivecooperativeeffect〕负协同效应〔negativecooperativeeffect〕动力学特点：不符合米曼方程双曲线。别构酶与非调理酶动力学曲线的比较别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase8.固定化酶固定化酶是经过吸附、耦联、交联和包埋等物理或化学的方法把酶衔接到某种载体上，做成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特点：稳定性提高，易分别，可反复运用，提高操作的机械强度。六、酶的分别纯化与酶活力测定1.酶的分别纯化根本原那么：提取过程中防止酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温暖猛烈搅拌等；要求在低温下操作，参与的化学试剂不使酶变性，操作中参与缓冲溶液.根本操作程序：选材：微生物〔微生物发酵物:胞内酶，胞外酶〕，动物〔动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等〕,植物〔木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等〕。抽提：参与提取液提取。胞内酶先要进展细胞破碎〔机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等〕，分别：先进展净化处置〔过滤，絮凝，离心脱色〕，再采用沉淀法分别〔盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等〕。纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。酶的制剂方式：固体：枯燥〔冰冻升华，喷雾枯燥，真空枯燥〕液体保管：低温下短期保管。2.酶活力的测定概念酶活力：又称为酶活性，普通把酶催化一定化学反响的才干称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反响速度来表示。根本原理:酶是蛋白质，种类多，构造复杂多样，普通对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反响的才干，这是基于在最优化条件下，当底物足够〔过量〕，在酶促反响的初始阶段，酶促反响的速度〔初速度〕与酶的浓度成正比〔即V=K［E］〕，故酶活力测定的是化学反响速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。酶活力测定酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)的生成〔添加〕量或底物〔S〕的耗费〔减少〕量。即测定时确定三种量：①参与一定量的酶；②一定时间间隔；③物质的增减量。测定酶活力常有以下几种方法：在一个反响体系中，参与一定量的酶液，开场计时反响，经一定时间反响后，终止反响，测定在这一时间间隔内发生的化学反响量〔终止时与起始时的浓度差〕，这时测得的是初速度。在一定条件下，参与一定量底物〔规定〕，再参与适宜量的酶液，测定完成该反响〔底物反响完〕所需的时间，〔非初速度，为一平均速度〕。动态延续测定法。在反响体系中，参与酶，用仪器延续监测整个酶促反响过程中底物的耗费或产物的生成。快速反响追踪法。近年来，追踪极短时间〔10-3s以下〕内反响过程的方法和安装曾经运用。其代表有停流法〔stopped-flow〕和温度跃变法〔temperaturejump〕。酶反响条件优化：测酶活所用的反响条件应该是最适条件，所谓最适条件包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严厉的反响时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。酶活力测定方法：反响计时。反响计时必需准确。反响体系必需预热至规定温度后，参与酶液并立刻计时。反响到时，要立刻灭酶活性，终止反响，并记录终了时间。终止酶反响，常使酶立刻变性，最常用的方法是参与三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停顿反响或用破坏其辅因子来停顿反响。反响量的测定。测底物减少量或产物生成量均可。在反响过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。详细物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质经过定量分析法测定。常用的方法有：光谱分析法：酶将产物转变为〔直接或间接〕一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。化学法：利用化学反响使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。放射性化学法：用同位素标志的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。3.酶活力的表示方法及计算酶活力单位酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的添加量表示，单位为mol/min等。酶活力单位的根本定义为：规定条件〔最适条件〕下一定时间内催化完成一定化学反响量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位〔activityunit〕或又称酶单位〔enzymeunit〕。国际单位：普通用活力单位U〔Unit〕表示，许多酶活力单位都是以最正确条件或某一固定条件下每分钟催化生成1μmol产物所需求的酶量为一个酶活力单位。一个“Katal〞单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=16067nKat以上的酶单位定义中，假设底物〔S〕有一个以上可被作用的化学键，那么一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。假设是两个一样的分子参与反响，那么每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U〞和“kat〞酶活力单位的定义和运用中，酶催化底物的分子量必需是知的，否那么将无法计算。习惯单位：在实践运用中，结果测定和运用都比较方便、直观，规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如：①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。〔QB546-80〕，也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg复原糖〔以葡萄糖计〕所需的酶量为一个酶单位。③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性内切酶：引荐反响条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。比活力〔specificactivity〕酶的比活力是每单位〔普通是mg〕蛋白质中的酶活力单位数〔如：酶单位/mg蛋白〕，实践运用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示〔如：酶单位/mL〔液体制剂〕，酶单位/g〔固体制剂〕〕，对同一种酶来讲，比活力愈高那么表示酶的纯度越高〔含杂质越少〕，所以比活力是评价酶纯度高低的一个目的。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力［总活力=比活力×总体积〔总分量〕］酶活力计算及计算举例酶活力计算是将实验中所用各种参数和所测得的实验数据〔反响时间、酶液稀释度和用量、产物生成量等〕换算成每毫升〔或每克〕酶制剂中所含的酶活力单位数。酶活力测定举例：福林-酚〔Lowry〕法测定蛋白酶活力。该方法的根本原理是以酪蛋白为底物进展反响，然后用福林-酚试剂显色，并用光度法测定酶促反响产物酪氨酸的生成量。测定在初速度阶段进展，为初速度法。

本章小结一、酶酶的概念酶催化作用的特点共性特性：条件温暖、高效率、专注性、易变敏感性二、酶的化学本质及构造功能特点酶：单纯酶结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子酶的辅因子维生素和辅酶维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类小分子有机物质。维生素普通习惯分为脂溶性和水溶性两大类。辅酶是一类具有特殊化学构造和功能的化合物。参与的酶促反响主要为氧化-复原反响或基团转移反响。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用亲密相关。酶构造与功能特点(1)活性中心：结合部位、催化部位、调控部位(2)必需基团(3)酶原和酶原的激活(4)同功酶三、酶的分类及命名四、酶作用的机制1.酶催化作用的本质：降低反响活化能2.酶催化作用的中间产〔络合〕物学说E+S====E-SP+E3.酶与底物结合构成中间络合物的方式：锁钥假说、诱导契合假说4.使酶具有高效催化的要素临近定向效应“张力〞和“形变〞酸碱催化共价催化五、酶促反响的速度及其影响要素1.底物浓度对酶促反响速度的影响米氏方程米氏常数Km的意义:米氏常数是反响速度为最大值的一半时的底物浓度。米氏常数的单位为mol/L。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。2.抑制剂对酶反响的影响抑制造用的类型：不可逆抑制造用可逆抑制造用竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制