血袋细菌内毒素定量检测方法的建立

血袋保养液细菌内毒素定量检测方法的建立钟炽辉细菌内毒素的根本知识1.细菌内毒素细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌及其它微生物的细胞壁层的脂多糖，主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三局部组成。内毒素能引起热原反响。2.细菌内毒素标准品细菌内毒素国家标准品〔RSE〕：批号：981效价：9000EU细菌内毒素工作标准品〔CSE〕：以细菌内毒素国家标准品为基准标定效价3.细菌内毒素在水溶液中的状态

细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中国药典明确注明：细菌内毒素标准溶液要混旋15min并且每稀释一步要混旋30s，以充分混匀。4.鲎试剂从海洋生物鲎的血液提取的生物试剂，只有鲎血与内毒素有特异性的凝胶反响，该试剂到达了国际标准化，全世界均采用该试剂检测细菌内毒素，尚不能采用生物合成的方法制造。实验证实，临界时间t0.02与内毒素浓度C之间也是负相关。通过对标准品进行实验，可得C-t0.02关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对实验品进行检测时，根据实验品的临界反响时间t0.02和标准曲线方程即可求出实验品的内毒素浓度。

6.2反响速率测定法大量实验说明，内毒素浓度越高成胶时间就越快，即反响速度越快，将动力学反响曲线变换成微积分曲线，即反响速率曲线，其反响速率最大的点即是反响曲线的拐点，该点的时间作为反响时间就是浊度反响时间法中的t50，最大的反响速率也与内毒素含量相关，通过对标准品进行实验，可得C-Vmax关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以解出a0、b0的值。在对试验品进行检测时，把试验品的最大反响速率Vmax代入标准曲线方程，即可求出其内毒素浓度值。7.血袋保养液细菌内毒素定量检测7.1材料：鲎试剂，内毒素工作标准品，检查用水，血液保存液调节液。7.2设备：BET-32M细菌内毒素分析仪，ZH-2BLENDER混合器。7.3标准曲线的设置7.3.1在软件里点击“使用以前标准曲线〞，可在软件右方框选择曾保存过的标准曲线；7.3.2在软件里点击“做新标准曲线〞，可重新制作标准曲线，具体步骤如下：〔1〕填好鲎试剂、内毒素、检查用水的批号；〔2〕分别设定好“初始浓度〞〔为标准曲线的最高浓度点〕、“稀释梯度〞〔为各标准点之间的稀释倍数〕、“浓度点数〞〔为所做标准曲线点的个数〕、“平行管数〞〔为各点重复的管数〕如以下图所示：〔3〕点击“自动设置标准曲线〞，在表格中出现所设置的数据，再点击“阴阳性对照〞，选中“阴性对照〞，填写平行管数，点击“试管位置选择〞，点击“自动选择〞，如以下图所示：

〔4〕点击“开始检测〞，程序设置完毕。新建立的标准曲线保存在“检品管理中心〞的标准曲线内，新标准曲线以默认【鲎试剂批号】+【内毒素批号】+【当前时间】作为文件名存盘，也可在画面底列“保存文件名〞处自行输入，如以下图所示：

〔5〕溶解分装鲎试剂根据用量溶解鲎试剂，将溶解的鲎试剂混合在一起，分装到无热原的仪器专用检测管内，每支检测管内0.1ml。〔6〕加样取稀释好的内毒素系列浓度溶液，根据所设定管数分别参加有鲎试剂的小试管中，每管0.1ml，另取细菌内毒素检查用水做阴性对照。〔7〕检测每个浓度点在加完样后应立即用封口膜封口，放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。待标准曲线最后一个浓度的OD值超过预设值后，用鼠标点击“手动停止检测〞，停止数据采集。〔8〕点击标准曲线坐标画面，生成并储存标准曲线，计算出相关系数。〔9〕报告打印点击“报告打印预览〞，在报告打印预览画面点击“打印〞即可，如以下图所示：7.4供试品的检测过程7.4.1供试品溶液制备根据干扰预试验结果，用血液保存液调节液将供试品稀释到无干扰浓度，同时制备该浓度的供试品阳性溶液和阳性标准品溶液，样品阳性溶液外加内毒素标准品浓度和阳性标准品浓度相同，标准品浓度为所选用标准曲线的中间浓度。7.4.2检测软件设置〔1〕点击“新试验〞，出现试验向导画面，首先填写鲎试剂批号、内毒素批号、检查用水批号，点击“供试品设置〞，选择供试品名称，所做供试品管的稀释倍数；填写供试品批号、稀释倍数平行管数。选中“回收率管〞，填写外加内毒素浓度、供试品稀释组数、“供试品稀释组数〞填写“1〞。点击自动设置，在表格中出现所设置数据。〔2〕点击“阴阳性对照〞画面，选中“阴性对照〞，填写平行管数，选中“阳性对照〞，填写平行管数。鼠标点击“试管位置选择〞，点击“自动选择〞后点击“开始检测〞，程序设置完毕。文件存在最后设置的“供试品名称〞目录下，以【供试品批号+当前时间】为该试验的文件名。7.4.3试验检测〔1〕溶解分装鲎试剂根据用量溶解鲎试剂，将溶解的鲎试剂混合在一起，分装到无热原的仪器专用检测管内，每只检测管内0.1ml。〔2〕加样取稀释好的供试品溶液、供试品阳性溶液、阳性标准品溶液，根据所设定平行管数分别参加有鲎试剂的小试管中0.1ml或0.2ml〔没有气泡〕，注意加样前应混合溶液30秒，且每个浓度加样前应更换加样头。另取细菌内毒素检查用水做阴性对照。〔3〕检测每个供试品在加完样后应立即用封口膜封口，放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。试验完成后，点击“手动停止检测〞，停止数据采集。在“标准曲线〞处选择标准曲线后，计算机自动计算出结果。〔4〕观察分析反响曲线在试验的过程中和试验结束后数据分析时可以观察每一个试管的反响曲线，以下图中的反响曲线为内毒素标准品的正常反响曲线，如果供试品中存在的干扰成分未被排除，它的反响曲线必定有所变化。另外，根据使用的不同鲎试剂，要适当调整显示幅度、零化期时间、预设OD值，以适应该种鲎试剂的反响特性。〔4〕试验报告打印用鼠标点击“报告打印预览〞，在报告打印预览画面点击“打印〞即可。8.结果分析8.1标准曲线：lrl=0.9992＞0.98，符合要求；8.2阴性对照：反响时间远大于标准曲线最低浓度所用反响时间，阴性合格；8.3回收率和样品：三种样品回收率分别为107%，102%，93%，内毒素含量小于限值，样品合格。注：样品回收率=〔样品阳性管检测值/20〕*100%8.4细菌内毒素检测结果数据检品编号检品名称批号稀释倍数外加内毒素EU/ml反应时间（s）内毒素值EU/ml限值EU/ml结论1阴性对照＞83902阳性对照402092420.6243红细胞保存液301