限制性内切酶和DNA体外重组的基本含义

一、DNA重组技术的基本含义1、基本概念

•DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把一个生物体中的遗传信息转入另一个生物体。2、基本步骤•目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的提取•限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段•酶接：连接到另一DNA分子上（克隆载体）•转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞•筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定•基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达。

二、限制性内切酶1、限制性内切酶的定义

是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。

2、限制性内切酶的发现•Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制－修饰。•Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为HindI,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。

限制性内切酶是如何工作的？3、限制性核酸内切酶的命名•按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。4、限制性内切酶的类型限制性内切酶可分为三大类型：•类型I和类型III：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。•类型II：是DNA重组技术最为常用的工具酶。类型II限制性内切酶的特点

•识别位点严格专一

•识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp•识别位点经常是一种回文序列的DNA

同切点酶（isoschizomer）：同裂酶——同识同切同裂酶——同识异切CTCGAGCCC一般的限制性内切酶反应条件1

Unit

定义：

限制性内切酶在50μL反应液中60分钟完全切断1μg

DNA（多数情况是λ噬菌体DNA

）。一般来说，1μL的内切酶与1μｇ的精制DNA在５０μL反应体系中（终浓度1倍的最适缓冲液中混合）在推荐温度下温育1小时。酶量过剩、延长反应时间与酶量过少、增加反应时间都可以完全切断目的DNA片段。切错地方了，咋办？有没有可能限制性内切酶切错了？限制性内切酶的Star活性应该注意利用限制性内切酶的要点,是反应液组成。酶的种类不同对反应最适合的盐浓度和pH等也不同。盐浓度太高或太低,pH很大地偏离既定值、酶的浓度太高,都有可能切断原来本不该切的序列(与识别序列相似但不相同的序列)。把这个称为限制性内切酶的Star活性。Star活性誘導条件１、甘油浓度过高「＞5%v/v」２、１μｇDNA相对应的酶Unit数过高（因酶不同而不同，一般＞100Unit/μｇ）３、离子强度低（＜25mM）４、pH值高（＞pH8.0）５、残存有机溶剂。６、Mg2+替换为其他二价离子。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）Star活性を阻害する条件１、在切断可能的范围内，尽量减少酶用量。２、确认完全除去制备DNA时的有机溶剂。３、反应溶剂的离子强度调至100-150mM。４、反应溶液的pH值调整到7。５、二价阳离子尽量使用Mg2+。2、Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’3’外切酶活性a、用于同位素标记DNA片段末端b、合成cDNA的第二条链c、Sanger双脱氧法进行序