DNA测序技术原理、应用与发展获奖科研报告

DNA测序技术原理、应用与发展获奖科研报告关键词：测序技术;发展历程;原理;应用与发展

1测序技术的发展历程

自Watson和Crick提出DNA双螺旋结构以来，生物学的研究逐渐深入到分子水平，DNA测序技术一步步发展，并且功能愈多、通量愈高，成本也迅速降低。Whitfeld使用化学毒素和同位素通过层析法进行多聚核苷酸测序。Sanger发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法。Maxam和Gilbertt提出了化学降解法。后来，荧光标记技术取代同位素标记技术，产生了自动化测序技术。同时期出现了杂交测序技术。能同时进行合成与测序的454测序技术的出现，标志着的二代测序技术的诞生。新一代的测序技术还包括了Solexa测序技术、SOLiD测序技术、CompleteGenomics测序方法和半导体测序技术。紧接着，以单分子测序为主要特点的第三代测序技术出现。2012年出现了纳米孔单分子测序技术、电子显微镜观察法等第四代测序技术。

2几代测序技术的基本原理

2.1第一代测序技术

Sanger发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法，引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），使用四种添加了放射性同位素标记的ddNTP，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过放射自显影可根据判断片段的大小和排序，确定整个片段的序列。

Maxam和Gilbertt提出化学降解法，使用32P对DNA链的5’端进行放射性标记，利用特殊化学方法修饰降解，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段后通过放射性自显影技术判断被标记的DNA断裂末端的碱基，达到测序目的。

杂交测序技术使用待测的变性DNA与已知的单链核苷酸进行杂交，根据杂交情况进行序列的排列，得到测序结果。

2.2第二代测序技术

二代测序技术通量高，成本也低。Solexa测序技术（illumina测序仪）的核心原理是边合成边测序，核心技术是DNA簇和可逆终止化学反应。在构建测序文库后，在随机断裂形成的DNA片段两端加上已知序列接头，进行桥式扩增，在含有基片的流通池内能够形成桥式结构。再经过30轮扩增后，基片上形成单克隆DNA簇。最后加入荧光可逆终止的四种dNTP和改造的DNA合成酶进行合成反应，通过机器检测荧光信号，测出核苷酸的序列，而dNTP上的荧光基因最终被化学切割、洗去。

454测序技术利用焦磷酸测序法，使用的是乳液PCR扩增单拷贝DNA片段的微球，而微球置于微孔板中于流通池内进行测序。

SOLID技术的核心是连接反应。构建文库，进行乳液PCR扩增，富集并沉积磁珠。以8碱基单链荧光探针混合物为连接的底物，引物与文库模板的P1接头序列杂交，四色荧光标记的双碱基探针与测序引物连接，进行循环连接检测和切割，达到测序目的。

CompleteGenomics测序在构建文库时由于两端加了接头，形成环状DNA模板，拷贝序列是类似滚环的扩增方式，形成单克隆DNA纳米球（DNB），利用锚定序列与探针的链接确定荧光信号测序。

半导体测序技术利用高密度半导体芯片检测dNTP聚合时产生H+的变化，实时进行测序，该法测序的灵敏度较高。

2.3第三代测序技术

碱基经过纳米级别的蛋白孔洞会产生跨膜电导率，可作为测序的依据，第三代测序技术就是建立在纳米孔基础上的技术。具有代表性的基于零级波导的SMRT系统测序核心在于观测DNA聚合。聚合酶催化单个带有荧光基团的核苷酸连接，在芯片小孔检测区内激发出荧光信号从而实现测序。

此外，还有tSMS单分子测序技术以及VisiGen测序技术。

2.4第四代测序技术

第四代测序技术的主要思想是直接读取DNA序列信息，目前有纳米孔单分子测序技术和电子显微镜观察法等方法，处于起步阶段，尚待研究。

3应用与发展

第一代测序技术问世后，人们开始进行人类DNA序列测定，绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序获得的，而毛细管电泳测序方法促进了人类基因组计划的完成。

第二代测序技术的发展，极大的加速了基因组测序、宏基因组测序、DNA甲基化测序、转录组测序、目标基因组区域再测序、基因的表观遗传修饰检测、微生物检测等领域的研究工作。其中，二代测序技术在肿瘤检测方面甚至其他疾病的治疗上有巨大的潜力。

第三代测序技术主要用于基因组测序、甲基化研究、突变鉴定（SNP检测）等方面，为一些变异快的微生物引起的疾病提供治疗策略，帮助人们更好地了解生命的发育过程和疾病的发生机制，也为生物学和功能方面的应用开辟新道路。

从测序技术的发展来看，DNA测序技术以生物学为基础，不断